本發(fā)明公開了一種體外復(fù)制的人線粒體DNA重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒包含完整的人線粒體DNA和大腸桿菌復(fù)制子基因；大腸桿菌復(fù)制子基因插入人線粒體DNA的D?LOOP區(qū)。其構(gòu)建方法包括以下步驟：提取完整的人線粒體DNA；從pUC19質(zhì)粒中擴增出大腸桿菌復(fù)制子基因、或擴增出大腸桿菌復(fù)制子基因和抗性篩選基因，作為插入人線粒體DNA中的外源基因；以及同時酶切人線粒體DNA和外源基因，將酶切過的人線粒體DNA和外源基因經(jīng)去磷酸化處理后連接在一起，制得人線粒體DNA重組質(zhì)粒。本發(fā)明一方面可實現(xiàn)人線粒體在原核生物中的復(fù)制，另一方面由于插入的為非編碼區(qū)，不會對人線粒體DNA的編碼功能造成影響。

1.一種人線粒體DNA重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒包含完整的人線粒體DNA和大腸桿菌復(fù)制子基因；所述大腸桿菌復(fù)制子基因插入人線粒體DNA的D-LOOP區(qū)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒還包含抗性篩選基因；所述抗性篩選基因插入到人線粒體DNA的D-LOOP區(qū)，并連接在所述大腸桿菌復(fù)制子基因的C端。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒，其特征在于，所述抗性篩選基因具有多克隆位點，所述多克隆位點為SalⅠ位點、BglⅡ位點和NotⅠ位點的至少兩個。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒，其特征在于，所述大腸桿菌復(fù)制子基因的N端和所述抗性篩選基因的C端均包含AleⅠ位點。5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒，其特征在于，所述抗性篩選基因為氨芐基因。6.一種人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：A、提取完整的人線粒體DNA；B、從pUC19質(zhì)粒中擴增出大腸桿菌復(fù)制子基因、或擴增出大腸桿菌復(fù)制子基因和抗性篩選基因，作為插入人線粒體DNA中的外源基因；以及C、同時酶切人線粒體DNA和外源基因，將酶切過的人線粒體DNA和外源基因經(jīng)去磷酸化處理后連接在一起，制得權(quán)利要求1所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟B包括：設(shè)計一對引物：引物3:5’-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’；引物4:5’-CAA ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC CAA AAG GCC AGC AAA AGG CCA-3’；基于PCR方法，使用引物3和引物4從pUC19質(zhì)粒中擴增出大腸桿菌復(fù)制子基因和抗性篩選基因。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，擴增出的所述大腸桿菌復(fù)制子基因的N端和所述抗性篩選基因的C端均包含AleⅠ位點；擴增出的所述抗性篩選基因具有多克隆位點，所述多克隆位點為SalⅠ位點、BglⅡ位點和NotⅠ位點的至少兩個 。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟B包括：設(shè)計一對引物：引物3:5’-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’；引物5:5’-CAA ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGCAGA TCA AAG GAT CTT CTT GAG-3’；基于PCR方法，使用引物3和引物5從pUC19質(zhì)粒中擴增出大腸桿菌復(fù)制子基因和抗性篩選基因。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，在所述步驟C中，使用限制性內(nèi)切酶AleⅠ同時酶切人線粒體DNA和外源基因，將酶切過的人線粒體DNA和外源基因經(jīng)去磷酸化處理后用T4連接酶連接在一起。