本發明涉及一種利用新鮮羊膜制備組織工程人工角膜內皮載體支架的方法，采用1∶1000硫酸妥布霉素液對新鮮羊膜進行浸泡消毒，經胰蛋白酶-EDTA消化液倒置消化后，用細胞刮刀輕刮羊膜上皮面以全部去除殘留上皮細胞，獲得去上皮層羊膜，平鋪在培養板孔中牢固干貼后，用去上皮層羊膜專用包被液進行包被處理，吸出包被液晾干后即可作為組織工程人工角膜內皮的載體支架使用。本發明工藝科學合理，所制備的載體支架可批量生產，以滿足組織工程人工角膜內皮規模化重建對載體支架的大量需求，為角膜內皮盲通過臨床角膜移植而復明創造條件，且該載體支架制備方法應用于組織工程人工角膜內皮體外重建和臨床治療的成本低。

1.一種利用新鮮羊膜制備組織工程人工角膜內皮載體支架的方法，首
先用眼科鑷撕除低溫保存新鮮羊膜的纖維細胞層和海綿層，用0.9%生理鹽
水沖洗干凈后，放入1:1000硫酸妥布霉素液中，置無菌操作臺內浸泡消毒
20～30分鐘后，用無菌D-Hanks溶液漂洗3～5分鐘；再依次采用倒置消化
法和細胞刮刀刮除法制備出去上皮層羊膜，用打孔器將羊膜打成直徑15.6
毫米的圓片，按上皮面朝上平鋪于24孔培養板孔中，放入5%CO₂培養箱
中、37℃進行干貼15～25小時；在無菌條件下向干貼有羊膜的24孔培養板
孔中，按1毫升/孔的量加入去上皮層羊膜專用包被液，將培養板置37℃培
養箱中包被處理15～25小時，再無菌吸出包被液，晾干后即可作為組織工
程人工角膜內皮的載體支架；所述去上皮層羊膜專用包被液的配方為
D-Hanks溶液和0.075‰～0.125‰IV型膠原；
上述1:1000硫酸妥布霉素液是500萬單位，用0.9%生理鹽水配制；
上述采用倒置消化法和細胞刮刀刮除法制備出去上皮層羊膜：是將已
滅菌濾紙平鋪于無菌玻璃板上，滴加0.1%～0.3%胰蛋白酶和0.01%～0.02%
EDTA消化液，其體積比為1:1，使滅菌濾紙充分濕潤，將羊膜按上皮面朝
下的方向平鋪于濾紙上，放至37℃培養箱中倒置消化30～60分鐘；
再用細胞刮刀輕刮已消化羊膜的上皮面，以全部去除殘留的上皮細胞，
用無菌D-Hanks溶液沖洗3～5次，獲得去上皮層羊膜。
2.如權利要求1所述的利用新鮮羊膜制備組織工程人工角膜內皮載體
支架的方法，其特征是所述去上皮層羊膜專用包被液中又添加了0.075‰
～0.125‰纖連蛋白。
3.如權利要求2所述的利用新鮮羊膜制備組織工程人工角膜內皮載體
支架的方法，其特征是上述去上皮層羊膜專用包被液中還添加了0.0075‰
～0.0125‰層粘連蛋白。