1.一種土壤中弓形蟲的分子檢測方法，其特征在于，通過設計弓形蟲特異引物對，提取被檢土壤樣品總
DNA，采用環介導的等溫擴增，對擴增產物進行分析以判定待測土壤樣品中所述弓形蟲是否為陽性或陰性，
其步驟如下：
(1)根據報道的登錄號為EU572718的弓形蟲MIC3基因序列設計特異引物對，所述的引物對的核苷酸序
列如下所示：
外引物對F3：5’-TAGATGTATTGATGACGCCTCG-3’；
外引物對B3：5’-TATTCATTTTTTCACTCAAGCTCC-3’；
內引物對BIP：5’-AATTCGGCATCAGCGCGTCCCCCGATTCTCCTTTCCCAT-3’；
內引物對FIP：5’-GACTTCGACTCCTTCCACACACGGAGAATGCTACACCTGCGAGT-3’；
促環形成引物對LF：5’-CTCCGCCTTGAAGTCACTC-3’；
促環形成引物對BF：5’-GATCTGCTTCCGCAACCTCC-3’；
(2)待檢土壤樣品的處理：將同一地點不同位置所采的土壤混合并自然晾干，過20目分析篩，去除土壤
中的石頭及雜草；
(3)待檢土壤樣品中DNA的提取：
1)將處理過的0.5g的土壤與0.5g的直徑為0.5mm的玻璃珠混合加入pH為8.0的2mL裂解緩沖液渦旋
3min直至土壤樣品被打散，在70℃下水浴1h；
2)將步驟1)的土壤樣品在5000r/min下離心10min，保留上清備用；
3)將步驟2)的沉淀用DNA提取液洗一次，于12000r/min下離心10min，幷將得到的沉淀溶于1.5mL
的DNA提取液中，得到混合物；
4)將步驟3)的混合物分別置于-20℃及65℃下水浴，循環3次，于12000r/min下離心10min后取清
并與步驟2)的上清合并；
5)用體積比為25∶24∶1的等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇溶液抽提2次，取水相加等體積的異丙醇沉
淀；
6)將步驟5)的樣品在12000r/min下離心10min，用100μL滅菌水溶解沉淀；
7)用DNA純化柱純化DNA樣品；
(4)環介導的等溫擴增：
1)建立環介導的等溫擴增反應體系：2.5μL?10×BstDNA聚合酶緩沖液，7.0mmol/L?MgCl2，1.0ng/
μL牛血清白蛋白，1mol/L甜菜堿，1.4mmol/L脫氧核苷酸，0.3μmol/L的引物F3和引物B3，1.6
μmol/L的引物FIP和引物BIP，0.8μmol/L的引物LF和引物LB，8U的BstDNA聚合酶，2μL?DNA
模板，滅菌雙蒸水補齊至25μL，其中陽性對照為土壤中提取的弓形蟲DNA，陰性對照為滅菌雙蒸水；
2)環介導的等溫擴增條件：95℃預變性5min后加入8U的BstDNA聚合酶至上述除酶以外的反應體系中，
再將其放置于63.5℃反應50min，然后80℃作用5min后終止反應；
3)擴增產物分析：采用顯色反應或瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，所述的顯色反應的步驟
為：加入1-2μL的熒光顯色劑1000×SYBR?Green?I至25μL的環介導等溫擴增的最終產物，在自
然光下用肉眼觀察結果，若擴增產物變為黃綠色則為弓形蟲陽性，若擴增產物為棕色則為弓形蟲陰
性；
所述的瓊脂糖凝膠電泳步驟為：取25μL的環介導等溫擴增的最終反應產物10μL，加入至含有
0.5μg/mL溴化乙錠染料的2％的瓊脂糖凝膠中，于100V電壓下電泳30min，在凝膠成相系統上成
像觀察結果，擴增產物為由不同大小的區帶組成的階梯式圖譜為弓形蟲陽性；
其中
步驟(3)的1)中的裂解緩沖液的組分及配比為：pH為8.0的50mmol/L?Tris，20mmol/L的EDTA，
100mmol/L的NaCl，1％十二烷基硫酸鈉，補足雙蒸水至1L；
步驟(3)的3)中DNA提取液的組分及配比為：pH為8.0的50mmol/L的Tris，20mmol/L的
EDTA，100mmol/L的NaCl，補足雙蒸水至1L。
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