本發(fā)明公開了一種折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒及其檢測(cè)方法。所述試劑盒由含鎂模板緩沖液及無鎂單一組合試劑組成，包含了板DNA制備和折疊引物PCR反應(yīng)全套試劑。所述折疊引物以瘧原蟲Cyt b基因作為靶基因，在瘧原蟲屬、種特異位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，顯著提高了折疊引物PCR檢出4種瘧原蟲的敏感性和特異性，同時(shí)簡化試劑和試驗(yàn)操作。采用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，使試劑復(fù)雜操作繁重的傳統(tǒng)套式/多重PCR簡化為單一試劑、單管一步擴(kuò)增反應(yīng)，即可同時(shí)檢出和鑒定4種瘧原蟲單獨(dú)或混合感染，檢出單種感染的低限均達(dá)到或接近1個(gè)蟲/μl血；在混合感染高、低密度相差100倍時(shí)仍能同時(shí)檢出和準(zhǔn)確鑒定4種原蟲。是省市各級(jí)醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室瘧疾確診和鑒別診斷的可靠手段。

1.一種折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒，所述診斷試劑盒由模板緩沖液和PCR單
一組合試劑組成；其中所述的模板緩沖液為1×含鎂模板緩沖液1.0ml×2支，或1×含鎂模
板緩沖液1.0ml×1支和0.1×模板緩沖液預(yù)裝0.5ml管×20支，所述預(yù)裝管每管400μl；其中
所述的單一組合試劑為折疊引物PCR無鎂單一組合試劑200μl×1支或預(yù)裝PCR管折疊引物
PCR無鎂單一組合試劑每管10μl×20支；其特征在于：
所述的1×含鎂模板緩沖液包含以下組分：30mmol Tris-HCl；30mmol KCl；15mmol
(NH₄)₂SO₄；6.6mmol MgCl₂；
所述的無鎂單一組合試劑包含以下組分：具有不同退火與折疊溫度的折疊引物6條；
Tris-HCl 30mmol/L；KCl 30mmol/L；NH₄SO₄ 15mmol/L；TMAC 0.001mmol/L；4種核苷酸-
4dNTP各200μmol/L；DNA聚合酶-Taq酶0.5U；石蠟油15μl；
所述的具有不同退火與折疊溫度的折疊引物，包括瘧原蟲屬特異公共引物一對(duì)，編號(hào)
Uf-1865、Ur-2855；惡性瘧原蟲(PF)種特異正向引物1條，編號(hào)Ff-2545；間日瘧原蟲(PV)、三
日瘧原蟲(PM)、卵形瘧原蟲(PO)種特異反向引物各1條，編號(hào)Vr-2343、Mr-2520、Or-2748；
所述引物的設(shè)計(jì)是在每條引物的5’端添加與3’端互補(bǔ)的核苷酸序列，所述3’端即第2
～4堿基起至第8～18堿基，具體序列如下：
Uf-1865 5'GTCAAATGGCGTGGAAACACACTTCCCTTCTCGCCATTTGATAG 3'
Ur-2855 5'CTAAGAAGGTTCGATAACCTGTTATCCCCGGCGAACCTTCTTAC 3'
Ff-2545 5'GCTTCTGGATATTATGATAGATAACATACCAGAAG 3'
Vr-2343 5'CGGTGATGCTACTTACTTGGAGAATGTTTTGCATCACCT 3'
Mr-2520 5'GGTATAAAGGATTTTAGTTTATCTCCATGTCCTTTATACG 3'
Or-2748 5'CGGAAGGATGTAAAAGCACATTTAATATCTTATCCTTCCA 3'
所述的折疊引物中，每條屬、種特異引物最佳初始退火溫度間至少相差2～3℃；各條引
物3’5’端互補(bǔ)退火的折疊溫度比引物與模板靶序列的初始退火溫度低1～2℃，各擴(kuò)增片段
之間的大小相差150bp以上。
2.如權(quán)利要求1所述的折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒，其特征在于，所述的折
疊引物中，屬和種特異引物Uf-1865、Or-2748、Mr-2520、Vr-2343的濃度均為87nmol/μL；Ur-
2855和Ff-2545的濃度均為70nmol/μL。
3.權(quán)利要求1或2所述的折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒在制備同時(shí)檢測(cè)和鑒定
臨床、流行病學(xué)樣本中存在的4種瘧原蟲單獨(dú)或混合感染產(chǎn)品中的用途，所述4種瘧原蟲為
惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲，其中卵形瘧原蟲包括經(jīng)典型和變異
型。
4.如權(quán)利要求3所述的折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒的用途，其特征在于，所
述試劑盒的檢測(cè)方法包括樣本模板DNA制備、折疊引物PCR即FP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)和擴(kuò)增產(chǎn)物電
泳分析鑒定，具體方法如下：
A、樣本模板DNA制備：將1片6mm直徑的濾紙血樣放入試劑盒提供的預(yù)裝0.1×模板緩沖
液400μl的0.5ml錐形管內(nèi)，室溫浸泡5～10分鐘，瞬時(shí)離心洗脫血紅蛋白，吸去全部液體，加
入1×模板緩沖液50μl，室溫平衡3分鐘，再吸去全部液體；重新加入1×模板緩沖液20～30μ
l,56℃孵育30分鐘，期間漩渦震蕩30秒×2次，升溫至95℃繼續(xù)加熱20分鐘，期間再次震動(dòng)
30秒×2次，瞬時(shí)離心10秒，吸取上清5μl作為FP-PCR模板；或整管4℃保存?zhèn)溆?，下次使用?br/>需再次加熱95℃5～10分鐘，漩渦震蕩30秒，瞬時(shí)離心后再吸取上清作為FP-PCR的模板；
B、折疊引物多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)：取出凍存試劑盒中預(yù)裝單一組合試劑PCR管，內(nèi)含無鎂
單一組合試劑10μl，置4℃冰盒回暖后，加入上述含鎂模板緩沖液制備的樣本模板DNA 5μl
即可上機(jī)反應(yīng)，反應(yīng)前先啟動(dòng)PCR儀，待升溫至86℃再放入PCR管；按下列溫度循環(huán)程序連續(xù)
擴(kuò)增反應(yīng)至少58個(gè)循環(huán)，即可獲得擴(kuò)增產(chǎn)物：
第1循環(huán)：(86℃/90s)X 1；
第2-5循環(huán)：(86℃/05s；68℃/10s；64℃/10s；62℃/10s；57℃/10s；
55℃/05s；75℃/15s；86℃/05s；57℃/10s；55℃/05s；72℃/05s；64℃/10s；62℃/10s；
75℃/15s)X 4；
第6-57循環(huán)：(86℃/05s；65℃/15s；72℃/10s；75℃/20s)X 52；
第58循環(huán)：(72℃/180s；10℃/180s)X 1；
C、擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析鑒定：
取擴(kuò)增產(chǎn)物5～8ul用含GelRed染料的2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，在紫外凝膠成像
儀下觀察攝像，按擴(kuò)增片段大小判定結(jié)果。
5.如權(quán)利要求4所述的折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒的用途，其特征在于，所
述試劑盒檢測(cè)的電泳鑒定標(biāo)準(zhǔn)是：PF種特異帶310bp,PV種特異帶479bp,PM種特異帶658bp，
PO種特異帶884bp；原蟲密度特高的模板可以同時(shí)出現(xiàn)有990bp瘧原蟲屬特異公共帶，如果
只有990bp公共帶而沒有任何種特異帶，則說明是4種以外的其他人瘧原蟲感染；健康人血
樣和空白陰性對(duì)照除少量二聚體外無其他擴(kuò)增條帶。