本發明涉及一種測定草坪草內源激素的方法，包括以下步驟：1）將草坪草用磷酸鈉緩沖液和二氯甲烷進行兩次提取，兩次離心后，然后氮氣吹干，得到草坪草內源激素；2）將步驟1）得到的草坪草內源激素用甲醇溶解后，利用固相萃取柱進行脫色脫脂，取洗脫液，然后真空抽干后，再用甲醇和乙酸的混合溶液溶解；3）以甲醇和乙酸作為流動相，利用高效液相色譜對經過步驟2）處理后的草坪草內源激素進行測定，得到草坪草內源激素的含量。本發明的方法選擇適宜的內源激素提取方法和色譜條件，準確測定草坪草內源激素的含量，與現有技術進行相比，具有回收率、提取效率高；準確率高、重復性好的優點。

1.一種測定草坪草內源激素的方法，包括以下步驟：
先配置0.05M，pH＝7.0磷酸鈉緩沖液，然后再用磷酸緩沖液溶解
二乙基二硫代氨基甲酸鈉，具體為100mL磷酸鈉緩沖液溶解
0.02～0.05g二乙基二硫代氨基甲酸鈉；
C₁₈固相萃取小柱為CNWBOND?LC-C18SPE小柱，500mg/3mL；
(1)選取草地早熟禾和黑麥草，分開提取和檢測，剪取0.3g新
鮮葉片，加液氮研磨至粉碎；
(2)加3mL?0.05M，pH＝7.0，含0.02％二乙基二硫代氨基甲酸鈉
的磷酸鈉緩沖液，保持葉片重g：提取液體積mL＝1:10，轉移到10mL
的離心管中，在4℃下震蕩1h后，用1M鹽酸調pH至2.6，再加入3mL
二氯甲烷，在4℃震蕩1h；
(3)取出離心管，將上個步驟得到的提取物在10000rpm下離心
10min，取下清液約3mL轉移至另一離心管中；殘渣再加入3mL二氯
甲烷，在4℃下繼續震蕩1h，10000rpm下離心10min，合并下清液；
(4)用氮氣吹干二氯甲烷，然后用1mL濃度80％甲醇溶解，渦
旋5min后，利用C₁₈固相萃取小柱進行脫色脫脂：先用5mL甲醇活化
C₁₈固相萃取小柱，再用5mL濃度80％甲醇平衡；然后再上草坪草內源
激素待測樣品，最后用1mL濃度80％甲醇洗脫，共收集2mL洗脫液，
35℃真空抽干；
(5)用400μL甲醇/0.075％乙酸溶液，V/V＝1:1的混合溶液溶解；
渦旋3min；然后過0.45μm濾膜，轉移至色譜瓶中；
(6)利用安捷倫1260高效液相色譜儀對脫色脫脂后的草坪草內
源激素樣品進行測定，其色譜條件為：
色譜柱為Agilent?C₁₈反相柱5μm,4.6mm×25cm；流動相為甲
醇∶0.075％的乙酸；流速為1mL/min；柱溫為30℃；進樣量為10μL；
檢測波長：ABA為262nm，IAA為280nm；以標樣出峰時間和峰高疊
加定性，外標法峰面積定量，梯度洗脫條件：

標準曲線的制備：
取適量母液，用甲醇：0.075％的冰乙酸＝1:1作為溶劑，配制成濃
度梯度為：0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μ
g/mL、1.6μg/mL、3.2μg/mL的標樣系列溶液，然后進行HPLC測定，
獲得標準曲線，從而建立起激素濃度和峰面積大小之間的函數關系；
激素標樣標準曲線方程分別為：Y_IAA＝0.0498X+0.0215，R2＝0.9998；
Y_ABA＝0.0138X-0.0026，R2＝0.9998；其中X為HPLC圖譜上的峰面積；
Y為樣品激素濃度μg/mL；
回收率的測定：
采用添加標樣法測定回收率：取同一盆草坪草葉片樣品3份，在
研磨時第1份不加激素標樣；第2份加入IAA和ABA標樣；第3份在步
驟(5)中加入IAA和ABA標樣，使其標樣激素含量與第2份的理論含
量相等，按提取步驟平行操作，并在相同的色譜條件下分別進樣，三
份樣品的色譜圖均出現與標樣相同保留時間的激素吸收峰；有標樣的
樣品上HPLC儀后，在這些激素的保留時間處色譜峰高和峰面積均增
大，說明樣品內源激素和添加的激素標樣疊加出峰，回收率＝(第3
份的峰面積-第1份的峰面積)/(第2份的峰面積-第1份的峰面積)
*100％，重復5次，所得結果為：IAA的平均回收率為95％，ABA的平
均回收率為90％。