本發(fā)明公開了一種檢測桃潛隱花葉類病毒的NASBA引物、試劑盒和方法，上游引物、下游引物的序列分別為 SEQ ID NO:1～2；NASBA擴增試劑盒，包括如下組分：（1）NASBA擴增反應(yīng)液A；（2）NASBA擴增反應(yīng)液B；檢測方法如下：1）樣品RNA的提取；2）進行PLMVd的NASBA擴增；3）電泳檢測。本發(fā)明適用于對桃潛隱花葉類病毒進行快速檢測確證，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境中的疫情監(jiān)控及進出口貿(mào)易中該類病毒的監(jiān)測及檢測，操作極為簡便，所需樣品量小且對于模板RNA的質(zhì)量要求較低。

1.一種檢測桃潛隱花葉類病毒的NASBA擴增試劑盒，包括如下組分：（1）NASBA擴增反應(yīng)液A:每25 μL包括10×AMV 緩沖液2.5 μl，6.25mmol /L NTPs 3 μL，10 mmol/L dNTPs 1.5 μL，10 μmol /L引物NA-P1、NA-P2各0.5 μL，雙蒸水9μL；其中緩沖液為含40 mmol/L PH8.5 Tris-HCL，70 mmol/LKCL，12 mmol/L MgCL2，5 mmol/L DTT緩沖液；（2）NASBA擴增反應(yīng)液B:0.5 U RNaseH，32 U T7RNA 聚合酶，6.4 U AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，2 μL DMSO，0.1 μL1 mol /L 二硫蘇糖醇，0.25 μL 10 mg /mL BSA，20 U RNA 酶抑制劑；引物NA-P1、NA-P2的序列分別為 SEQ ID NO:1～2。2.利用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測桃潛隱花葉類病毒的NASBA方法，包括下列步驟：1）樣品RNA的提取A、取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入1 mLTrizol Reagent，顛倒混勻，2℃~8℃，12000 g，離心10min；B、取上清，15℃~30℃，放置5min；加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩，不要渦旋振蕩，15s；15℃~30℃，放置2min~3min；2℃~8℃，12000 g，離心15min；C、吸取600 μL的上層水相，勿擾動中間相和下層相，加500 μL異丙醇混合上清液，15℃~30℃，放置10min，2℃~8℃，12000 g，離心10min；D、去除上清液，沉淀中加入1 mL75%乙醇，洗滌；2℃~8℃，7500 g，離心5min；E、去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 μL ~50 μL無RNase的水中，即為待檢模板RNA；2）進行PLMVd的NASBA擴增A、 在裝有14 μL NASBA擴增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3μL 待檢模板RNA；B、在DNA擴增儀或水浴鍋上65℃溫浴5 min，立即轉(zhuǎn)入41℃溫浴5 min；C. 在反應(yīng)管中迅速加入4 μL反應(yīng)液B；D. 于41℃溫育2 h；E. 將金屬浴調(diào)到4 ℃中止反應(yīng)，3 min后取出；3）電泳檢測取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3 mL～6 mLPCR擴增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。