本發(fā)明涉及一種用于以RT-LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的引物、試劑盒、檢測方法。該引物包括HTNV引物組和SEOV引物組，兩引物組分別包括外引物對，內(nèi)引物對，以及環(huán)引物對，其序列如SEQ？ID？NO:3-14所示。該試劑盒包括上述引物、反應(yīng)緩沖液及酶液。該檢測方法包括：配制反應(yīng)液A、B，加入待測核酸樣品，反應(yīng)，結(jié)束反應(yīng)并鑒定結(jié)果。本發(fā)明結(jié)果可靠，能快速、高效、高特異性、高靈敏性的檢測腎綜合征出血熱病毒，并準(zhǔn)確分型。

1.一種用于以RT－LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的引物，其特征是，
包括HTNV引物組和SEOV引物組；其中，
HTNV引物組由外引物對HTNV－F3和HTNV－B3，內(nèi)引物對HTNV－FIP和
HTNV－BIP，以及環(huán)引物對HTNV－LF和HTNV－LB組成；
HTNV－F3的序列如SEQIDNO：3所示，HTNV－B3的序列如SEQIDNO：4所
示，HTNV－FIP的序列如SEQIDNO：5所示，HTNV－BIP的序列如SEQIDNO：6
所示，HTNV－LF的序列如SEQIDNO：7所示，HTNV－LB的序列如SEQIDNO：8
所示；
SEOV引物組由外引物對SEOV－F3和SEOV－B3，內(nèi)引物對SEOV－FIP和
SEOV－BIP，以及環(huán)引物對SEOV－LF和SEOV－LB組成；
SEOV－F3的序列如SEQIDNO：9所示，SEOV－B3的序列如SEQIDNO：10所
示，SEOV－FIP的序列如SEQIDNO：11所示，SEOV－BIP的序列如SEQIDNO：12
所示，SEOV－LF的序列如SEQIDNO：13所示，SEOV－LB的序列如SEQIDNO：14
所示。
2.一種以RT－LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的試劑盒，其特征是，包
括權(quán)利要求1所述用于以RT－LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的引物，其中由
HTNV引物組構(gòu)成的引物混合液放置于Ⅰ管中，由SEOV引物組構(gòu)成的引物混合
液放置于Ⅱ管中；還包括反應(yīng)緩沖液和酶液，所述酶液中的酶為BstDNA聚合
酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述以RT－LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的試劑盒，
其特征是，所述Ⅰ管中，外引物對HTNV－F3和HTNV－B3、內(nèi)引物對HTNV－FIP
和HTNV－BIP、以及環(huán)引物對HTNV－LF和HTNV－LB的摩爾比為1：(6－10)：(3－6)；
所述Ⅱ管中，外引物對SEOV－F3和SEOV－B3、內(nèi)引物對SEOV－FIP和SEOV－BIP、
以及環(huán)引物對SEOV－LF和SEOV－LB的摩爾比為1：(6－10)：(3－6)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述以RT－LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的試劑盒，
其特征是，還包括HTNV陽性對照品和SEOV陽性對照品，濃度分別為30－100
mg/L，且由以下方法獲得：構(gòu)建含有腎綜合征出血熱病毒漢灘型的S基因的質(zhì)
粒HTNV－PCRⅡ、并構(gòu)建含有腎綜合征出血熱病毒漢城型的S基因的質(zhì)粒
SEOV－PCRⅡ，然后分別進(jìn)行酶切線性化、體外轉(zhuǎn)錄及RNA純化，所得cRNA片
段分別為HTNV陽性對照品和SEOV陽性對照品；所述腎綜合征出血熱病毒漢灘
型的S基因序列如SEQIDNO：1所示，所述腎綜合征出血熱病毒漢城型的S基
因序列如SEQIDNO：2所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述以RT－LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的試劑盒，
其特征是，所述反應(yīng)緩沖液為2×反應(yīng)緩沖液，包括40－60mmol/LpH8.8的
Tris－HCl，18－30mmol/L的KCl，10－30mmol/L的(NH₄)₂SO₄，質(zhì)量濃度為0.1－0.3％
的TritonX－100，由濃度均為2.8－3.6mmol/L的dATP、dTTP、dCTP、dGTP
組成的dNTPs，0.8－2.0mmol/L的甜菜堿C₅H₁₁NO₂，以及14－20mmol/L的MgSO₄；
所述酶液包括濃度為8－12U/μl的BstDNA聚合酶，以及濃度為10－16U/
μlAMV逆轉(zhuǎn)錄酶；
還包括顯色試劑，所述顯色試劑為濃度4－20mmol/L的金屬離子指示劑HNB
儲存液。
6.權(quán)利要求1所述引物用于制作以RT－LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒
的試劑盒的用途。
7.一種非診斷目的以RT－LAMP法檢測腎綜合征出血熱病毒的快速檢測方
法，其特征是，采用權(quán)利要求2至5任一項(xiàng)所述以RT－LAMP法檢測腎綜合征出
血熱病毒的試劑盒，該方法包括以下步驟：
第一步、向透明反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的2×反應(yīng)緩沖液、Ⅰ管
或Ⅱ管的引物混合液、酶液、顯色試劑、超純水，然后混合，得到體積相同的
反應(yīng)液A、B；其中反應(yīng)管A中加入Ⅰ管的引物混合液，反應(yīng)管B中加入Ⅱ管的
引物混合液；2×反應(yīng)緩沖液、Ⅰ管或Ⅱ管的引物混合液、酶液、顯色試劑、
超純水的體積比為(6－12)：(1.2－3.4)：(0.5－1.6)：(0.2－0.8)：(3.0－4.5)；
第二步、向反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的待測核酸樣品，蓋好反應(yīng)
管A、B后混勻；
第三步、將反應(yīng)管A、B先分別在60℃－65℃恒溫條件下放置25－60min
進(jìn)行RT－LAMP擴(kuò)增，再于80℃－95℃下放置2－10min結(jié)束反應(yīng)；
第四步、觀察反應(yīng)液A、B的顏色，若反應(yīng)液A顏色為天藍(lán)色，則待測核
酸樣品中含有腎綜合征出血熱病毒漢灘型；若反應(yīng)液B顏色為天藍(lán)色，則待測
核酸樣品中含有腎綜合征出血熱病毒漢城型；若反應(yīng)液A、B顏色均為紫羅蘭
色，則待測核酸樣品中不含腎綜合征出血熱病毒漢灘型和腎綜合征出血熱病毒
漢城型。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述非診斷目的以RT－LAMP法檢測腎綜合征出血熱病
毒的快速檢測方法，其特征是，第一步中，反應(yīng)管A、B中均不加顯色試劑；
在第一步結(jié)束時(shí)先以濁度儀檢測反應(yīng)液A、B的濁度，再進(jìn)行第二步；第四步
中，以濁度儀檢測結(jié)束反應(yīng)后的反應(yīng)液A、B濁度，并觀察反應(yīng)前后反應(yīng)液A、
B的濁度變化，若反應(yīng)液A濁度上升，則待測核酸樣品中含有腎綜合征出血熱
病毒漢灘型；若反應(yīng)液B濁度上升，則待測核酸樣品中含有腎綜合征出血熱病
毒漢城型；若反應(yīng)液A、B濁度均無變化，則待測核酸樣品中不含腎綜合征出
血熱病毒漢灘型和腎綜合征出血熱病毒漢城型。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述非診斷目的以RT－LAMP法檢測腎綜合征出血熱
病毒的快速檢測方法，其特征是，第二步中，加入待測核酸樣品后，反應(yīng)管A、
B中的反應(yīng)液體積均為25μl；第三步中，RT－LAMP擴(kuò)增條件為：63℃恒溫條件
下放置30min；結(jié)束反應(yīng)的條件為：80℃下放置2min。