1.結合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測試劑盒，其特征在于，包括：(1)一步法RT-PCR反應混合液：25μL的反應體系中，包括One Step Enzyme Mix1μL，2×1 Step Buffer12.5μL，引物對1的濃度為0.4μM，所述引物對1具有SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列，具體地，引物對1的序列如下：正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(SEQ ID NO：1)反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID NO：2)(2)NEST-PCR反應混合液：20μL的反應體系中，包括Premix Taq Mix10μL，引物對2的濃度為0.4μM，所述引物對2具有SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列，具體地，引物對2的序列如下：正向引物：TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID NO：3)反向引物：ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(SEQ ID NO：4)2.根據權利要求1所述的結合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測試劑盒，其特征在于，使用方法包括：(1)、RNA的獲取：提取待測草魚組織的總RNA，作為RT-PCR反應的模板；(2)、RT-PCR擴增：采用25μL的擴增體系，將反應混合液置于PCR儀進行RT-PCR擴增，所述反應混合液中，包括步驟(1)獲取的RNA模板2μL，One Step Enzyme Mix1μL，2×1 StepBuffer12.5μL，引物對1的濃度為0.4μM，余量由DEPC處理水補足，放入PCR儀進行RT-PCR擴增，其中，所述引物對1具有SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列，具體地，引物對1的序列如下：正向引物：CCCTAATCCTCGCATACTCCACAAC(SEQ ID NO：1)反向引物：TCTTTCACAAATAACCCGTCTCCCG(SEQ ID NO：2)(3)、檢測RT-PCR擴增結果：取RT-PCR擴增產物，用1％的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統中成像，電泳圖片在349bp大小處有條帶，則確定該樣品攜帶草魚出血病病毒GCRV-GD108株，若電泳圖片在349bp大小處沒有條帶，則繼續進行步驟(4)；(4)、NEST-PCR擴增：以電泳圖片在349bp大小處沒有條帶的RT-PCR擴增產物作為模板，進行NEST-PCR擴增，采用20μL的擴增體系：DNA模板2μL，EX Taq Mix10μL，引物對2的濃度為0.4μM，其余為由滅菌ddH2O補足，其中，所述引物對2具有SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列，具體地，引物對2的序列如下：正向引物：TGACAGTGCGATTGACAGAGTT(SEQ ID NO：3)反向引物：ATATATGTATAGTGGCGCGTCC(SEQ ID NO：4)(5)、檢測NEST-PCR擴增結果：取NEST-PCR擴增產物，用1％的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統中成像，電泳圖片在206bp大小處有條帶，判定該樣品帶有草魚出血病病毒GCRV-GD108株。3.根據權利要求2所述的結合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述步驟(1)具體包括：A、組織預處理：樣品預處理：取待測草魚樣品的組織300mg，加入600μL TN緩沖液,勻漿，室溫12000g離心15min，取上清；所述TN緩沖液為20mM Tris-HCl、0.4M NaCl,其pH為7.4；所述勻漿操作為使用電動勻漿機打5次，每次5-6sec；B、Trizol試劑提取病毒RNA：在1mL Trizol試劑中加入150μL粗提取液，依照Trizol試劑提取RNA的步驟進行，最后溶解30uL DEPC水中，用槍頭輕打幾次或室溫20min，直接用于RT-PCR擴增，或-20度短暫保存、或-80℃冰箱保存。4.根據權利要求2所述的結合RT-PCR與NEST-PCR的草魚出血病病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述步驟(4)中，NEST-PCR擴增的條件為：94℃，預變性2min；進入35個循環：98℃10sec，56℃30sec，72℃50sec；最后一個循環結束后72℃延伸10min，4℃保存。
展開
