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一種非病毒iPSCs誘導方法及其誘導組合物、試劑盒及其獲得的iPSCs

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2021-07-28
  • 技術成熟度:通過中試
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201610411378.X 
  • 技術(專利)名稱 一種非病毒iPSCs誘導方法及其誘導組合物、試劑盒及其獲得的iPSCs 
  • 項目單位 廣州市搏克生物技術有限公司
  • 發明人 王淋立,陳月花,宋立兵,莫健 
  • 行業類別 醫藥制造-中藥飲片
  • 技術成熟度 通過中試
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 吳潘
  • 發布時間 2021-07-28  
  • 01

    項目簡介

    本發明公開一種非病毒iPSCs誘導方法及其誘導組合物、試劑盒及其獲得的iPSCs。具體地,該誘導方法包括以下步驟:1)將表達重編程因子POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4、MYCL和hsa?miR?302s的DNA序列構建到附加體質粒中,得到重組質粒;2)將步驟1)得到的重組質粒導入人的體細胞中,進行誘導培養,得到iPSCs。該方法在不加入高風險重編程因子,如c?MYC、SV40?LT、TP53抑制因子等的情況下,使用安全性高的重編程因子組合,降低了iPSCs的臨床適用風險;該方法具有較高的適用性。
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  • 02

    說明書

    1.一種非病毒iPSCs誘導方法,其特征在于,包括以下步驟:1)將表達重編程因子POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4、MYCL和hsa-miR-302s的DNA序列構建到附加體質粒中,得到重組質粒;其中,所述hsa-miR-302s序列為包含hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR-302d中的任一種或兩種以上的序列;所述重編程因子不包含TP53抑制因子、SV40-LT或c-MYC中的任意一種;2)將步驟1)得到的重組質粒導入人的體細胞中,進行重編程誘導培養,得到iPSCs。2.如權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟1)中,所述hsa-miR-302s DNA序列中還包含hsa-miR-367的DNA序列。3.如權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟1)中,通過II型啟動子連接并起始轉錄POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4和MYCL表達。4.如權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟1)中,通過EF-1α、CMV或CAG啟動子連接并起始轉錄POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4和MYCL表達。5.如權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟1)中,通過I型、II型或III型啟動子連接并起始轉錄hsa-miR-302s表達。6.如權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟1)中,通過CMV、U6或H1啟動子連接并起始轉錄hsa-miR-302s表達。7.如權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟1)中,所述重編程因子POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4和MYCL采用IRES類或2A類共表達元件,進行兩個或兩個以上表達蛋白的重編程因子基因在單啟動子下共表達。8.如權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟1)中,所述重編程因子POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4和MYCL采用IRES1、IRES2、P2A或F2A共表達元件,進行兩個或兩個以上表達蛋白的重編程因子基因在單啟動子下共表達。9.如權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟1)中,將重編程因子POU5F1和GLIS1通過P2A共表達元件連接并使用EF-1α啟動子起始轉錄,KLF4和SOX2通過P2A共表達元件連接并使用EF-1α啟動子起始轉錄,將含有POU5F1、GLIS1、KLF4和SOX2四個基因的DNA序列共同構建至一附加體質粒;將重編程因子MYCL和hsa-miR-302s分別通過EF-1α啟動子和CMV啟動子起始轉錄,并將其DNA序列構建至一附加體質粒。10.如權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟2)中,在誘導培養過程中加入小分子化合物,所述小分子化合物為MEK抑制劑、GSK-3β抑制劑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑、賴氨酸特異性去甲基化酶抑制劑中一種或兩種以上。11.如權利要求10所述的方法,其特征在于,步驟2)中,所述小分子化合物為PD0325901、CHIR-99021、丁酸鈉和反苯環丙胺鹽酸鹽的組合。12.如權利要求11所述的方法,其特征在于,步驟2)中,所述PD0325901濃度為0.1-2μM,所述CHIR-99021濃度為0.1-6μM,所述丁酸鈉濃度為0.05-2mM,所述反苯環丙胺鹽酸鹽的濃度為0.1-10μM。13.如權利要求10所述的方法,其特征在于,步驟2)中,在誘導培養的第0天至第12天的任意一天或兩天以上加入上述小分子化合物。14.如權利要求10所述的方法,其特征在于,步驟2)中,在誘導培養的第0天至第8天每天加入上述小分子化合物。
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