本發明涉及生物技術領域，特別是用于擴增腸道病毒71型時用到的一套優化的工藝方法。該方法以聚纖維紙片為載體利用生物反應器擴增非洲綠猴腎細胞，從而建立腸道病毒71型復制擴增的全套工藝流程。本方法建立在對腸道病毒71型復制擴增體系全面適應的條件下，在細胞培養階段用含10%的血清的DMEM培養基，在病毒接種吸附后至24小時使用帶3-5%的血清DMEM培養基，在收獲病毒階段采用無血清培養基添加0.5%的水解乳蛋白，同時每24小時補充2g/L的葡萄糖，該方法在減輕后期純化難度并適應生物制品的要求的基礎上，使優化工藝達到較高的病毒滴度。具有良好重復性、高效腸道病毒71型擴增工藝，可適用于任何以聚纖維紙片為載體的生物反應器擴增腸道病毒71型。

1.一種用生物反應器擴增腸道病毒71型的優化工藝方法，其特征在于該方法以聚纖維紙片為載體,利用生物反應器擴增非洲綠猴腎細胞，在細胞培養階段用含10%的血清的DMEM培養基，培養細胞第六天換液成無血清培養基，吸附腸道病毒71型病毒3小時，加入5%胎牛血清，繼續培養22小時，棄去全部培養液，并用磷酸緩沖液PBS沖洗去除血清，全部換成無血清培養基加0.5%水解乳蛋白，靜止再吸附2小時利于更多細胞均勻感染病毒，接種病毒后每24小時添加2g/L的葡萄糖,獲得較高病毒滴度的優化工藝方法。2.根據權利要求1所述的用生物反應器擴增腸道病毒71型的優化工藝方法，其特征在于具有如下步驟：1）在生物反應器內加入生長液，接種綠猴腎VERO細胞，批次換液培養5-6天，密度達到6×10⁶個/ml以上，接種腸道病毒71型，35℃靜止吸附3小時，加入5%胎牛血清，繼續培養擴增病毒，（2）在吸附病毒22小時，換液成無血清培養基加0.5%水解乳蛋白，靜止再吸附2小時，繼續培養，每24小時左右批次換液收獲；（3）72-96小時后，細胞每日葡萄糖消耗低于2g/L，共收獲上清20L用于濃縮、純化；（4）用膜包濃縮20-50倍，用于進一步純化。3.?根據權利要求1所述的用生物反應器擴增腸道病毒71型的優化工藝方法，其特征在于生物反應器所用聚纖維紙片載體為150克。4.?根據權利要求1所述的用生物反應器擴增腸道病毒71型的優化工藝方法，其特征在于腸道病毒71型接種量即感染復數MOI為0.5,即病毒顆粒數和細胞數比值。5.?根據權利要求1所述的用生物反應器擴增腸道病毒71型的優化工藝方法，其特征在于接毒后收獲方式采用批式收獲或連續灌注收獲，同時補充相同體積的維持液，收獲時間點為48、72、96和120小時。6.?根據權利要求1所述的用生物反應器擴增腸道病毒71型的優化工藝方法，其特征在于生物反應器設定參數：（1）細胞培養階段pH7.2-7.6、溫度37℃、溶氧50-80%、攪拌速度50-60rpm；（2）接毒后，pH7.2-7.3、溫度35℃、溶氧50-70%、攪拌速度50-60rpm。