本發明提供了一種雙光子溶酶體pH熒光探針及其制備方法和應用。該探針是利用苯并咪唑橋連咔唑衍生物構建基于分子內電荷轉移效應的pH熒光探針。制法：將苯并咪唑與咔唑衍生物溶于少量N,N?二甲基甲酰胺，加入三甲基氯硅烷催化，于封管內反應，然后加入飽和NaCO溶液調節pH至弱堿性，減壓濃縮、硅膠柱分離得純品。該探針具有接近溶酶體pH平衡的pK值。對H具有高的靈敏度、好的選擇性和大的Stocks位移。該探針在結合H前后顏色變化明顯，可裸眼識別。該探針以咔唑衍生物為雙光子熒光團，利用雙光子熒光成像技術證實該探針與市售綠色溶酶體探針具有良好的共定位性，可應用于HeLa細胞溶酶體內pH變化的檢測。

1.一種苯并咪唑類的雙光子溶酶體pH熒光探針在檢測細胞內溶酶體pH中的應用，所述
應用是非疾病診斷和非疾病治療的，所述苯并咪唑類的雙光子溶酶體pH熒光探針的結構式
為：

2.如權利要求1所述的一種苯并咪唑類的雙光子溶酶體pH熒光探針在檢測細胞內溶酶
體pH中的應用，其特征在于，所述熒光探針制備步驟：
(1)在封管內，將2-甲基苯并咪唑，9-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-9H-咔唑-3-甲醛和
三甲基氯硅烷按摩爾比1～1.5:1:10～15溶于N,N-二甲基甲酰胺，100～140℃加熱反應20
～28小時；
(2)向反應液中加入飽和Na₂CO₃溶液調節溶液pH值至弱堿性，攪拌至少0.5小時，用
CH₂Cl₂萃取3次，合并有機相，無水Na₂SO₄干燥后，減壓蒸餾得到粗品；
(3)粗品經硅膠柱分離，得到純品。
3.如權利要求2所述的一種苯并咪唑類的雙光子溶酶體pH熒光探針在檢測細胞內溶酶
體pH中的應用，其特征在于，所述步驟(1)中2-甲基苯并咪唑，9-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙
基)-9H-咔唑-3-甲醛和三甲基氯硅烷的摩爾比為1.2:1:12，反應溫度100℃，反應時間24小
時。
4.如權利要求2所述的一種苯并咪唑類的雙光子溶酶體pH熒光探針在檢測細胞內溶酶
體pH中的應用，其特征在于，所述步驟(2)中攪拌時間為1小時。