本發明涉及一類基于熒光素衍生物的內標比率型熒光探針、制備方法及其應用，以熒光素衍生物作為起始原料，以丙二腈、三氰基苯、吲哚、吡喃腈等作為輔助熒光單元，以丙烯?；?、2,4?二硝基苯磺酰基等作為生物標志物響應單元。通過引入輔助熒光單元，實現了對該類熒光探針吸收波長及雙通道熒光發射波長的調控：吸收波長為400nm?750nm；雙通道熒光發射，通道一發射波長為520nm，通道二發射波長為517nm?720nm。針對不同生物標志物的檢測，通過連接不同的識別基團，實現了對通道一熒光強度調控：探針與生物標志物響應后，通道一熒光強度顯著增強；通道二熒光強度保持不變，實現了內標比率型熒光探針對生物標志物的定量檢測。

1.一種基于熒光素衍生物的內標比率型熒光探針，其為式Ⅰ所示化合物： A為O,S或Si；B為O,S或N-R₁；R₁選自H,NH₂,C₁～C₄的烴基或苯基；C為O、或式Ⅱ所示基團：丙二腈(Ⅱ-1)或三氰基化合物(Ⅱ-2)或多元取代雜環(Ⅱ-3,4,5)； 其中所述式Ⅱ中，式Ⅱ-2中：R₂選自苯基；式Ⅱ-3中：R₃選自O或N-R₁₂,R₁₂選自C₁～C₄的直鏈烷基；R₄與R₅的組合為苯基；式Ⅱ-4中：R₆與R₇的組合為苯基或式Ⅴ；R₈選自C₁～C₄的直鏈烷基；式Ⅱ-5中：R₉選自H,C₁～C₃的直鏈烷基；R₁₀、R₁₁選自苯基或F； D為O-R₁₃,NH-R₁₄,R₁₃,R₁₄分別獨立選自H，或式Ⅲ-1A,Ⅲ-1B,Ⅲ-1C,或Ⅲ-2A； E為H、或式ⅣA,ⅣB： 2.如權利要求1所述的基于熒光素衍生物的內標比率型熒光探針，其特征在于，式Ⅰ中，C為O、或式Ⅱ所示基團：丙二腈(Ⅱ-1)或三氰基化合物(Ⅱ-2A)或多元取代雜環(Ⅱ-3A,3B,4A,5A)； 3.如權利要求1所述的基于熒光素衍生物的內標比率型熒光探針，其特征在于，式Ⅰ中，A為O。4.如權利要求1所述的基于熒光素衍生物的內標比率型熒光探針，其特征在于，式Ⅰ中，B為O。5.如權利要求1所述的基于熒光素衍生物的內標比率型熒光探針，其特征在于，式Ⅰ為式Ⅰ-1,Ⅰ-2或Ⅰ-3： 6.如權利要求5所述的基于熒光素衍生物的內標比率型熒光探針，其特征在于，Ⅰ為式Ⅰ-1A,Ⅰ-2A,Ⅰ-1B,Ⅰ-1C,Ⅰ-1D,Ⅰ-2D,Ⅰ-1E,Ⅰ-1F,或Ⅰ-1G； 7.如權利要求6所述的基于熒光素衍生物的內標比率型熒光探針，其特征在于，Ⅰ為式1-1D-1或1-1D-2； 8.如權利要求1～7中任意一項所述的基于熒光素衍生物的內標比率型熒光探針作為內標比率型探針的應用。9.一種基于熒光素衍生物的內標比率型熒光探針的制備方法，是以熒光素衍生物作為起始原料，以丙二腈、三氰基苯、吲哚、吡喃腈作為輔助熒光單元，以丙烯?；?、2,4-二硝基苯磺酰基作為生物標志物響應單元，制備得到可對熒光探針吸收波長及雙通道熒光發射波長調控的熒光探針。10.根據權利要求9所述的一種基于熒光素衍生物的內標比率型熒光探針的制備方法，其特征在于，所述吸收波長為400nm-750nm；雙通道熒光發射，通道一發射波長為520nm，通道二發射波長為517nm-720nm。