本發明公開一種電化學發光探針三聯吡啶釕?CBT及其制備方法與應用，涉及生物檢測技術領域。該方法是在CABT上引入活潑氨基，得到活潑氨基?CBT，用于修飾到三聯吡啶釕上；通過氨基、羧基脫水縮合作用將活潑氨基?CBT修飾到Ru(bpy)上，得到電化學發光探針Ru(bpy)?CBT。本發明的方法更加簡單快速，且通用性好，對于不同的靶標蛋白酶的檢測，通過更換相應的多肽底物序列，就可以實現對不同蛋白酶的檢測，應用范圍廣，對蛋白酶的檢測特異性好，靈敏度高。探針設計簡單，操作步驟簡短，易于在科研和臨床診斷等領域推廣和應用；檢測策略簡單，無特殊的材料修飾和處理要求。

1.一種電化學發光探針Ru(bpy)₃²⁺-CBT的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
(1)在CABT上引入活潑氨基，得到活潑氨基-CBT，用于修飾到三聯吡啶釕上；
(2)通過氨基、羧基脫水縮合作用將活潑氨基-CBT修飾到Ru(bpy)₃²⁺上，得到電化學發
光探針Ru(bpy)₃²⁺-CBT；
步驟(1)中所述的活潑氨基-CBT為glycine-CBT；
所述的glycine-CBT的結構如下所示：

步驟(2)中所述的Ru(bpy)₃²⁺來自Ru(bpy)₂dcbpy(PF₆)₂；
所述的Ru(bpy)₂dcbpy(PF₆)₂的結構如下所示：

所述的Ru(bpy)₃²⁺-CBT的結構如下所示：

2.一種電化學發光探針Ru(bpy)₃²⁺-CBT，其特征在于，所述的Ru(bpy)₃²⁺-CBT的結構如
下所示：

3.權利要求2所述的電化學發光探針Ru(bpy)₃²⁺-CBT在檢測蛋白酶活性中的應用。
4.一種基于電化學發光探針Ru(bpy)₃²⁺-CBT檢測蛋白酶活性的方法，其特征在于包括
如下步驟：
(Ⅰ)多肽底物與待檢蛋白酶樣品共孵育，然后加入蛋白酶抑制劑終止酶切反應，得到蛋
白酶切產物CK-Biotin；
所述的多肽底物序列模式為XXXXCK-Biotin，XXXX為蛋白酶特異性識別序列，多肽底物
在被蛋白酶切割后會產生一個二肽Cys-Lys-Biotin；
(Ⅱ)權利要求2所述的電化學發光探針Ru(bpy)₃²⁺-CBT與蛋白酶切產物CK-Biotin組裝
反應，生成組裝復合物Ru(bpy)₃²⁺-CBT-CK-Biotin；
(Ⅲ)利用鏈霉親和素包被的磁珠富集、分離復合物Ru(bpy)₃²⁺-CBT-CK-Biotin；
(Ⅳ)對步驟(Ⅲ)分離得到的Ru(bpy)₃²⁺-CBT-CK-Biotin進行電化學發光分析，從而間
接反映蛋白酶的催化量；
所述的基于電化學發光探針Ru(bpy)₃²⁺-CBT檢測蛋白酶活性的方法的線路如下所示：

5.根據權利要求4所述的基于電化學發光探針Ru(bpy)₃²⁺-CBT檢測蛋白酶活性的方法，
其特征在于：
步驟(Ⅱ)中所述的電化學發光探針Ru(bpy)₃²⁺-CBT與酶切產物CK-Biotin組裝反應的
條件為：室溫下溫和震蕩反應15～60min。
6.根據權利要求4所述的基于電化學發光探針Ru(bpy)₃²⁺-CBT檢測蛋白酶活性的方法，
其特征在于：
步驟(Ⅰ)中所述的多肽底物工作濃度為1μM；
步驟(Ⅱ)中所述的電化學發光探針Ru(bpy)₃²⁺-CBT工作濃度為5μM。
7.根據權利要求4所述的基于電化學發光探針Ru(bpy)₃²⁺-CBT檢測蛋白酶活性的方法，
其特征在于：
步驟(Ⅲ)中所述的鏈霉親和素包被的磁珠對形成的組裝復合物Ru(bpy)₃²⁺-CBT-CK-
Biotin的富集及分離條件為：將磁珠加入到酶切溶液體系中后，室溫下溫和震蕩反應15～
30min，用磁分離架將磁珠與溶液分離，每個樣品再分別用PBS溫和重懸洗滌4次，最終用PBS
重懸磁珠。
8.根據權利要求4所述的基于電化學發光探針Ru(bpy)₃²⁺-CBT檢測蛋白酶活性的方法，
其特征在于：
步驟(Ⅳ)中所述的電化學發光分析平臺為羅氏Elecsys2010電化學發光全自動免疫分
析儀及相關配套試劑。