本發(fā)明公開了一種靈敏特異的朊病毒蛋白(PrP)檢測(cè)方法與檢測(cè)試劑，其技術(shù)要點(diǎn)在于：將蛋白酶處理后的樣本流經(jīng)偶聯(lián)能與朊病毒蛋白（PrP）特異識(shí)別并結(jié)合的重組G5P蛋白的Ni-NTA樹脂，洗滌后經(jīng)洗脫緩沖液洗脫并收集，洗脫液所含的朊病毒蛋白（PrP）通過其特異抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)或電泳后染色可被檢測(cè)。該方法結(jié)合了PrPSC蛋白酶抗性和與G5P高親和特性，有效消除正常PrP所致的假陽性，特異性強(qiáng)；蛋白純化效果好，抗體免疫檢測(cè)靈敏度高；該方法具有廣泛的應(yīng)用前景和價(jià)值。該方法的建立對(duì)朊病毒的研究、疾病的診斷和控制有著重要的意義。

1.一種檢測(cè)朊病毒蛋白PrP^SC的方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟一：將待測(cè)樣本經(jīng)10μM蛋白酶K消化，使樣本中正常的PrP被水解，而PrP^SC因其蛋白酶抗性不被水解，以消除正常PrP的影響；步驟二：將步驟一處理后的待測(cè)樣本流經(jīng)飽和偶聯(lián)能與朊病毒蛋白PrP^SC特異識(shí)別并結(jié)合的重組G5P蛋白的Ni⁺-NTA樹脂，利用該重組G5P蛋白捕獲待測(cè)樣本中的朊病毒蛋白PrP^SC，所述的能與朊病毒蛋白PrP^SC特異識(shí)別并結(jié)合的重組G5P蛋白是由序列表中序列1基因編碼表達(dá)的；步驟三：用洗脫緩沖液對(duì)經(jīng)過步驟二后的飽和偶聯(lián)能與朊病毒蛋白PrP^SC特異識(shí)別并結(jié)合的重組G5P蛋白的Ni⁺-NTA樹脂進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，所述的洗脫緩沖液的組成及濃度為：20mmol/L?Tris-Cl，150mmol/L?NaCl，500mmol/L咪唑，pH為7.0；步驟四：用以下方法檢測(cè)步驟三收集到的洗脫液中的朊病毒蛋白PrP^SC：(a)洗脫的PrP^SC為不溶性蛋白，量多則可見白色沉淀；或(b)洗脫后凝膠電泳經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色出現(xiàn)明顯條帶即為PrP^SC；或(c)利用PrP^SC單克隆抗體進(jìn)行PrP^SC的Western?blot檢測(cè)。2.一種用于檢測(cè)朊病毒蛋白PrP^SC的試劑盒，其特征在于，包括：(a)朊病毒蛋白PrP^SC的富集洗脫體系：即飽和偶聯(lián)能與朊病毒蛋白PrP^SC特異識(shí)別并結(jié)合的重組G5P蛋白的Ni⁺-NTA樹脂和洗脫緩沖液，所述的能與朊病毒蛋白PrP^SC特異識(shí)別并結(jié)合的重組G5P蛋白是由序列表中序列1基因編碼表達(dá)的；所述的洗脫緩沖液體系的組成及濃度為：20mmol/L?Tris-Cl，150mmol/L?NaCl，500mmol/L咪唑，pH為7.0；(b)蛋白酶K，用于樣本處理；(c)PrP^SC單克隆抗體，用于洗脫的朊病毒蛋白PrP^SC免疫印跡檢測(cè)；(d)說明書。3.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，它是由序列表中序列1所示的能與朊病毒蛋白PrP^SC特異識(shí)別并結(jié)合的G5P蛋白的編碼基因與攜帶His-Tag的pET-28a(+)質(zhì)粒重組而成。4.一種能與朊病毒蛋白PrP^SC特異識(shí)別并結(jié)合的重組G5P蛋白的克隆表達(dá)方法，包括以下步驟：步驟1、G5P重組子的構(gòu)建：(1)參照GeneBank的Accession?No.J02450所示G5P氨基酸序列對(duì)應(yīng)的基因序列，根據(jù)大腸桿菌BL21-DE3密碼子偏愛性設(shè)計(jì)出序列表中序列1所示的重組G5P蛋白表達(dá)基因；(2)通過DNASTAR比對(duì)，用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)合成序列表中序列1所示基因的8段引物，并在兩端引入同pET-28a(+)質(zhì)粒一樣含有的EcoR?Ⅰ和Xho?Ⅰ酶切位點(diǎn)，以便酶切連接；8段引物序列如下：Pr1:CGGAATTCATGATTAAAGTTGAAATT?Pr2:GAAACACCAGAACGGGTGGTGAACTGCGCCTGAGACGGTTTAATTTCAACTTTAATCAT?Pr3:CACCCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAACCGTATTCAGTGAATGAGCAGCTGTGTT?Pr4:AATCTTGACCAGCACCGGATACTGATTACCCAGATCAACGTAACACAGCTGCTCATTCA?Pr5:CCGGTGCTGGTCAAGATTACCCTGGATGAAGGTCAGCCGGCCTATGCGCCGGGTCTGTA?Pr6:AACCGAACTGACCAACTTTGAACGAGGACAGATGAACGGTGTACAGACCCGGCGCATAG?Pr7:AAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTGATGATTGATCGTCTGCGCCTGGTTCCGGCGAAATAA?Pr8:ATCTCGAGTTATTTCGCCGGAACCAG?其中Pr1的劃線部分是EcoR?I酶切位點(diǎn)，Pr8的劃線部分是Xho?I酶切位點(diǎn)；(3)利用重疊延伸PCR合成目的基因序列，并PCR擴(kuò)增目的基因；重疊延伸PCR反應(yīng)體系：PCR擴(kuò)增目的基因的條件：(4)分別用Xho?I和EcoR?I于37℃水浴雙酶切目的基因和質(zhì)粒pET-28a(+)-c(+)4h，各自回收后，將兩者用T4DNA連接酶于16℃連接反應(yīng)10h，得到重組子pET-28a(+)-c(+)-G5P，瓊脂糖凝膠電泳鑒定；步驟2、G5P重組子的表達(dá)：(1)將重組子pET-28a(+)-c(+)-G5P轉(zhuǎn)化于E.coli?BL21-DE3感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；(2)取少量上述菌液按1：100比例轉(zhuǎn)接到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200r/min搖床培養(yǎng)至OD600＝0.6～0.8；(3)加入一定量的0.2-1.2mM?IPTG誘導(dǎo)2-12h；(4)將誘導(dǎo)后的菌液冰浴30min，8000rpm離心20min，4℃，棄上清；(5)用含20mM?NaH₂PO₄，0.5M?NaCl，1％TritonX-100，pH7.4的裂解液重懸細(xì)菌沉淀，超聲波破碎，4℃，12000rpm離心20min，收集上清液；(6)加入終濃度為5ug/ml的DNase和RNase，30℃水浴30min，消除核酸干擾，收集上清，利用攜帶His標(biāo)簽的重組G5P蛋白與Ni⁺-NTA樹脂形成穩(wěn)定的親和偶聯(lián)特性，使用Ni⁺-NTA瓊脂糖層析柱純化上清液中相對(duì)分子質(zhì)量為9.5KD的重組G5P蛋白，并SDS-PAGE分析鑒定。