本發(fā)明涉及一種利用核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測結(jié)核分枝桿菌的快速檢測技術(shù)，以及定性檢測的試劑盒。該試劑盒包含無儀器DNA提取試劑盒、結(jié)核分枝桿菌核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、防污染核酸擴(kuò)增物檢測裝置、結(jié)核分枝桿菌陽性對照、結(jié)核分枝桿菌陰性對照。本發(fā)明的檢測試劑盒特異性高、靈敏度高；反應(yīng)速度快，單個樣本從樣本處理到完成檢測，僅需1～1.5小時；可同時滿足中通量和低通量的樣品檢測，特別適合現(xiàn)場檢測以及基層醫(yī)院使用，且整個反應(yīng)過程只需一個恒溫儀器。

1.一種利用核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測結(jié)核分枝桿菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：?(1)無儀器DNA提取試劑盒；所述的無儀器DNA提取試劑盒包括：微量核酸提取裝置、抽吸裝置、細(xì)胞裂解液、清洗液及洗脫液；?(2)結(jié)核分枝桿菌核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液；?(3)陽性對照：為含有結(jié)核分枝桿菌IS6110基因的DNA片段；?(4)陰性對照：為無菌雙蒸水；?其中，所述結(jié)核分枝桿菌核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的組成為：?正向外圍引物 0.01～0.05μmol； 反向外圍引物 0.01～0.05μmol； 正向交叉引物 0.01～0.05μmol； 反向交叉引物 0.01～0.05μmol； 正向探針 0.1～0.5μmol； 反向探針 0.1～0.5μmol； MgSO₄3～6mmol； dNTPs溶液 0.2～0.4mmol； Bst?DNA聚合酶 6～10U； 10×Thermol?buffer 2μl； 無菌雙蒸水 補(bǔ)足到16μl； 其中，所述的正向外圍引物為SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；?所述的反向外圍引物為SEQ?ID?NO:2所示的核苷酸序列；?所述的正向探針為5’端標(biāo)記有Biotin的SEQ?ID?NO:3所示的核苷酸序列；?所述的反向探針選自3’端標(biāo)記有FitC的SEQ?ID?NO:4所示的核苷酸序列；?所述正向交叉引物選自SEQ?ID?NO:5所示的核苷酸序列；?所述反向交叉引物選自SEQ?ID?NO:6所示的核苷酸序列。?2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于，結(jié)核分枝桿菌核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的組成為：?正向外圍引物 0.03～0.05μmol； 反向外圍引物 0.03～0.05μmol； 正向交叉引物 0.03～0.05μmol； 反向交叉引物 0.03～0.05μmol； 正向探針 0.3～0.5μmol； 反向探針 0.3～0.5μmol； MgSO₄5～6mmol； dNTPs溶液 0.3～0.4mmol； Bst?DNA聚合酶 8～10U； 10×Thermol?buffer 2μl； 無菌雙蒸水 補(bǔ)足到16μl。 3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述結(jié)核分枝桿菌核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的組成為：?正向外圍引物 0.05μmol； 反向外圍引物 0.05μmol； 正向交叉引物 0.05μmol； 反向交叉引物 0.05μmol； 正向探針 0.5μmol； 反向探針 0.5μmol； MgSO₄6mmol； dNTPs溶液 0.4mmol； Bst?DNA聚合酶 10U； 10×Thermol?buffer 2μl； 無菌雙蒸水 補(bǔ)足到16μl。 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的微量核酸提取裝置包括管狀主體（1），管狀主體一端設(shè)有用于與抽吸裝置連接的接頭（2），另一端為插頭（3），用于與核酸結(jié)合的濾芯裝置（4）安裝于管狀主體或插頭內(nèi)；微量核酸提取裝置的管狀主體與插頭為一體或由管狀主體與插頭兩個部件連接而成，其中，所述插頭為錐狀。?5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述的10×Thermol?buffer含有摩爾濃度為20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及質(zhì)量濃度為0.1%的Triton?X-100，pH8.8。?6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于：所述的結(jié)核分枝桿菌陽性?對照含有如SEQ?ID?NO:7所示的、長198bp的結(jié)核分枝桿菌IS6110基因序列。?7.根據(jù)權(quán)利要求1～6任一所述的結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，其特征在于：所述的結(jié)核分枝桿菌陽性對照中的結(jié)核分枝桿菌DNA，制備方法包括下列步驟：?（1）利用兩條外圍引物SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因；?（2）對步驟（1）得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；?（3）將步驟（2）得到的純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒構(gòu)建完整的含有目的基因SEQ?ID?NO:7所示的質(zhì)粒序列；?（4）將所抽提的質(zhì)粒定量并稀釋至10⁶拷貝/μl，-20℃保存。?