本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人類MTHFR基因多態(tài)性檢測試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。所述試劑盒由分別用于擴增MTHFR基因rs1801133、MTHFR基因rs1801131 2個位點的PCR預(yù)混反應(yīng)液、陽性對照品及陰性對照品組成，所述PCR預(yù)混反應(yīng)液包含用于擴增各位點的特異性引物序列組、探針組和PCR反應(yīng)液，所述特異性引物組由普通的外引物和帶熒光標(biāo)簽的特異性的ARMs引物組成。本發(fā)明所述試劑盒用于檢測人類MTHFR基因多態(tài)性具有靈敏度高、特異性高、操作簡便、結(jié)果可靠等優(yōu)點，且能在1小時內(nèi)完成檢測，并且結(jié)果判讀簡單客觀。

1.一種檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由分別用于擴增MTHFR基因rs1801133、MTHFR基因rs1801131位點的PCR預(yù)混反應(yīng)液、陽性對照品及陰性對照品組成；所述PCR預(yù)混反應(yīng)液的具體組分如下：所述用于擴增MTHFR基因rs1801133位點的PCR預(yù)混反應(yīng)液：由用于擴增MTHFR 基因rs1801133位點的引物組、序列如SEQ ID NO：1~4所示，其中SEQ ID NO.2所示引物的5’端攜帶FAM熒光基團，SEQ ID NO.4所示引物的5’端攜帶VIC熒光基團；用于內(nèi)控的引物組、序列如SEQ ID NO：9~10所示，探針組、序列如SEQ ID NO：11~13所示，以及PCR反應(yīng)液組成；所述用于擴增MTHFR基因rs1801131位點的PCR預(yù)混反應(yīng)液：由用于擴增MTHFRrs1801131位點的引物組、序列如SEQ ID NO：5~8所示；其中SEQ ID NO.6所示引物的5’端攜帶FAM熒光基團，SEQ ID NO.8所示引物的5’端攜帶VIC熒光基團；用于內(nèi)控的引物組、序列如SEQ ID NO：9~10所示；探針組、序列如SEQ ID NO：11~13所示；以及PCR反應(yīng)液組成；所述探針組的具體形式如下：內(nèi)控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’野生型淬滅基團鎖核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’突變型淬滅基團鎖核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’ ；所述陽性對照品包括：MTHFR基因rs1801133位點野生型質(zhì)粒、MTHFR基因rs1801133位點突變型質(zhì)粒、MTHFR基因 rs1801131位點野生型質(zhì)粒、MTHFR基因 rs1801131位點突變型質(zhì)粒及內(nèi)控基因質(zhì)粒DNA；所述陰性對照品包括不包含內(nèi)控基因和目的基因位點的重組質(zhì)粒。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR預(yù)混反應(yīng)液中，探針組內(nèi)taqman-MGB探針的濃度為50~100nM，攜帶淬滅基團的鎖核酸探針的濃度均為100~400nM；用于擴增各位點的不帶熒光基團的各引物濃度均為100~400nM，帶熒光基團的各引物濃度均為50~100nM；用于內(nèi)控的引物的濃度均為100~400nM。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液包括Premix qPCRmix和TE緩沖液。4.權(quán)利要求1~3任一項所述檢測試劑盒在制備用于檢測人類MTHFR基因多態(tài)性產(chǎn)品中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，具體的檢測方法包括如下步驟：（1）采用基因組DNA提取試劑盒提取待測人外周血的基因組DNA作為待檢測樣本；（2）熒光定量檢測：向反應(yīng)管中加入PCR預(yù)混反應(yīng)液和待測樣本DNA；同時設(shè)置陽性對照組和陰性對照組，然后將反應(yīng)管置于熒光PCR儀進行PCR擴增反應(yīng)，并采集FAM、VIC和ROX熒光信號；（3）PCR擴增反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)所采集的熒光信號起線情況進行結(jié)果判定。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（1）中將所述待檢測樣本DNA稀釋到濃度為0.1~100ng/μL，再進行PCR擴增反應(yīng)。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（2）所述PCR擴增反應(yīng)的條件為：95℃1分鐘預(yù)變性；15個循環(huán)：95℃ 5秒，61℃ 32秒，不收集熒光；30個循環(huán)：95℃ 5秒，61℃ 32秒，收集熒光。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（3）所述結(jié)果判定的準(zhǔn)則為：①當(dāng)陽性對照組均有FAM、VIC、ROX熒光信號起線，陰性對照組均無FAM、VIC、ROX熒光起線，待檢測樣本有ROX熒光信號起線時，判定實驗成功，可以進行后續(xù)分型判定；② 根據(jù)檢測樣本的FAM、VIC熒光信號判斷MTHFR基因rs1801133的分型：VIC熒光信號起線MTHFR基因rs1801133位點分型為純合野生型；FAM熒光信號起線，MTHFR基因rs1801133位點分型為純合突變型；VIC、FAM熒光信號均起線，MTHFR基因rs1801133分型為雜合突變型；③ 根據(jù)檢測樣本的FAM、VIC熒光信號判斷MTHFR基因rs1801131的分型：VIC熒光信號起線，MTHFR基因rs1801131位點分型為純合野生型；FAM熒光信號起線，MTHFR基因rs1801131位點分型為純合突變型；VIC、FAM熒光信號均起線，MTHFR基因rs1801131位點分型為雜合突變型。