為了克服現有方法及試劑盒的不足,本發明提供了一種基于酶切靈敏檢測人類EGFR基因突變的方法及其試劑盒，屬于基因突變檢測領域。本發明通過在EGFR基因片段擴增體系中引入耐熱DNA連接酶和針對突變位點處的特定連接引物組，可以基于擴增片段條帶直接判定野生型樣本或使得低突變含量樣品其最終的PCR產物中突變片段的比例高于50%；然后通過變性和退火，制備在突變位點處含有錯配構造的DNA片段雜交樣品，從而利用錯配切除酶實現對雜合基因片段樣品的有效檢測。本發明方法及試劑盒可以基于酶切檢測出樣本中含量低至1%的EGFR基因突變，準確率極高，檢測時間較短且費用低廉，適合于臨床檢測。

1.基于酶切檢測人類 EGFR 基因突變的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括10×PCR
緩沖液、10×耐熱 DNA 連接酶緩沖液、dNTPs、8條擴增引物、9 條連接引物、耐熱 DNA 連接
酶、DNA 聚合酶、10×錯配切除酶緩沖液和錯配切除酶 ；所述8 條擴增引物其序列如
SEQ.ID NO.1-SEQ.ID NO.8所示，其中SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2、SEQ.ID NO.3 和SEQ.
ID NO.4、SEQ.ID NO.5 和 SEQ.ID NO.6、SEQ.ID NO.7 和SEQ.ID NO.8 分別用于靶向第
18、 19、20、21 號外顯子片段的擴增；所述 9 條連接引物其核苷酸序列如 SEQ.ID NO.9-
SEQ.ID NO.17 所示，所述連接引物其5’端第一個核苷酸均進行磷酸化修飾，其中SEQ.ID
NO.9 靶向 第18號外顯子的3 種突變位點，SEQ.ID NO.10 靶向第19號外顯子的19種突變
位點，SEQ. ID NO.11-SEQ.ID NO.15 靶向第20號外顯子的5種突變位點，SEQ.ID NO.16-
SEQ.ID NO.17 靶向第21號外顯子的2 種突變位點；
所述錯配切除酶為T7核酸內切酶I或芹菜Cel I 酶，酶活單位不低于500 單位/mL。
2.根據權利要求 1 所述的基于酶切檢測人類EGFR基因突變的試劑盒，其特征在于：所
述 10×PCR 緩沖液是由 100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KCl 和 15mmol/L MgCl₂組
成，pH=8.3 ；所述10×耐熱DNA連接酶緩沖液的配制為 ：20 mM Tris-HCl、25 mM 乙酸鉀、
10 mM 乙酸鎂、1 mM 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、10 mM 二硫蘇糖醇DTT、0.1% Triton X-
100，pH=7.6 ；所述 dNTPs 是由 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP 各 2.5mmol/L 混合而成的；所
述擴增引 物的濃度均為10umol/L；所述連接引物的濃度均為10umol/L；所述耐熱 DNA 連
接酶的酶活力單位濃度不低于4000U/uL，在正常體系下 95℃保溫 1h 酶活力不低于原酶
活的 60% ；所述DNA聚合酶的酶活力單位濃度為5U/uL，具有耐熱性能。