本發(fā)明公開了一種多重PCR檢測腸道新發(fā)原蟲試劑盒，其用于同時檢測隱孢子蟲、賈第蟲，環(huán)孢子蟲和微孢子蟲，該試劑盒包括如下引物：隱孢子蟲的特異性引物：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2；賈第蟲的特異性引物：SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4；環(huán)孢子蟲的特異性引物：SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6；微孢子蟲的特異性引物：SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8。此外本發(fā)明還公開了一種隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲的多重PCR檢測方法。通過各種驗證表明本發(fā)明具有快速、敏感、特異性強的特點，解決了進行多次PCR檢測的繁瑣步驟，一次反應(yīng)可以達到同時檢測多個基因，明確病原體的作用，大大減輕了工作量，縮短了檢測時間，降低了檢測成本，具備更大的發(fā)展趨勢。

1.一種多重PCR檢測腸道新發(fā)原蟲試劑盒，其特征在于，其用于同時檢測隱孢子蟲、賈
第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲，該試劑盒包括如下引物：
隱孢子蟲的特異性引物：
Cry-F：5’-TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3’，SEQ ID NO.1；
Cry-R：5’-CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT-3’，SEQ ID NO.2；
賈第蟲的特異性引物：
Gia-F：5’-AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG-3’，SEQ ID NO.3；
Gia-R：5’-GCACGCTTAGCCTTCTTGGC-3’，SEQ ID NO.4；
環(huán)孢子蟲的特異性引物：
Cycl-F：5’-GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA-3’，SEQ ID NO.5；
Cycl-R：5’-CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT-3’，SEQ ID NO.6；
微孢子蟲的特異性引物：
Micro-F：5’-ACGGAGGCGAAGGCGACACT-3’，SEQ ID NO.7；
Micro-R：5’-CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG-3’，SEQ ID NO.8。
2.一種隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲的多重PCR檢測方法，所述方法不包括
疾病診斷和治療方法，其特征在于，具體步驟包括如下:
(1)隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲的蟲體DNA提取；
(2)引物設(shè)計與篩選；所述設(shè)計的引物序列為：
隱孢子蟲的特異性引物：
Cry-F：5’-TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3’，SEQ ID NO.1；
Cry-R：5’-CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT-3’，SEQ ID NO.2；
賈第蟲的特異性引物：
Gia-F：5’-AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG-3’，SEQ ID NO.3；
Gia-R：5’-GCACGCTTAGCCTTCTTGGC-3’，SEQ ID NO.4；
環(huán)孢子蟲的特異性引物：
Cycl-F：5’-GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA-3’，SEQ ID NO.5；
Cycl-R：5’-CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT-3’，SEQ ID NO.6；
微孢子蟲的特異性引物：
Micro-F：5’-ACGGAGGCGAAGGCGACACT-3’，SEQ ID NO.7；
Micro-R：5’-CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG-3’，SEQ ID NO.8；
(3)質(zhì)粒構(gòu)建；
(4)建立多重PCR方法，對所設(shè)計的引物進行PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，得到最佳多重PCR模式；
(5)按照步驟(4)的PCR反應(yīng)條件進行PCR擴增特異性驗證；
(6)按照步驟(4)的PCR反應(yīng)條件進行PCR敏感性驗證；
(7)按照建立的多重PCR方法對樣本進行檢測和可行性驗證。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)具體為：將隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子
蟲和微孢子蟲進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物回收連接到pMD19-T載體，第二天進行轉(zhuǎn)化；以單菌落
為模板進行PCR擴增，每個培養(yǎng)板各挑取5個菌落，每個樣本接1個陽性箘落，37℃，過夜培
養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行PCR鑒定，并將PCR結(jié)果正確的質(zhì)粒送測序。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，所述的PCR反應(yīng)條件優(yōu)化具體方
法為：退火溫度根據(jù)引物合成后參考溫度，選取57℃、60℃進行PCR，根據(jù)擴增效果確定退火
溫度，最后確定最佳的多重PCR模式。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，退火溫度為60℃。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，所述最佳多重PCR模式具體為：最
佳多重PCR反應(yīng)體系：30μL反應(yīng)體系中ddH₂O 6μL，PCR-Mix 15μL，隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子
蟲和微孢子蟲上下游引物各0.5μL；Mgcl₂ 3μL，模板DNA 2μL；最佳的多重PCR反應(yīng)條件為：
95℃3min；95℃30s，70℃30s，72℃30s，4個循環(huán)；95℃30s、68℃30s、72℃30s，4個循環(huán)；95℃
30s、60℃30s、72℃30s，40個循環(huán)；72℃10min。
7.用于同時檢測隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲的引物，其特征在于，其序列
為：
隱孢子蟲的特異性引物：
Cry-F：5’-TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3’，SEQ ID NO.1；
Cry-R：5’-CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT-3’，SEQ ID NO.2；
賈第蟲的特異性引物：
Gia-F：5’-AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG-3’，SEQ ID NO.3；
Gia-R：5’-GCACGCTTAGCCTTCTTGGC-3’，SEQ ID NO.4；
環(huán)孢子蟲的特異性引物：
Cycl-F：5’-GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA-3’，SEQ ID NO.5；
Cycl-R：5’-CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT-3’，SEQ ID NO.6；
微孢子蟲的特異性引物：
Micro-F：5’-ACGGAGGCGAAGGCGACACT-3’，SEQ ID NO.7；
Micro-R：5’-CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG-3’，SEQ ID NO.8。
8.如權(quán)利要求7所述的引物在制備多重PCR檢測腸道新發(fā)原蟲試劑盒中的應(yīng)用。