本發(fā)明公開(kāi)了一種基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體快速共檢的方法和試劑盒，該試劑盒由具有富集抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體功能的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠、多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG抗體納米探針、質(zhì)控品以及PBST緩沖液所組成；質(zhì)控品包括陽(yáng)性質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；陽(yáng)性質(zhì)控品為人肺炎衣原體感染者的抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體分別為陽(yáng)性的血清；陰性質(zhì)控品是抗人肺炎衣原體IgM、IgG均為陰性的人血清。本發(fā)明具有簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體的同步檢測(cè)。

1.一種用于制備基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎衣原體IgM、IgG
抗體快速共檢試劑盒的方法，所述基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎衣
原體IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒由具有富集抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體功能
的抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠、多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG抗體
納米探針、質(zhì)控品以及PBST緩沖液所組成；所述質(zhì)控品包括陽(yáng)性質(zhì)控品以及陰性
質(zhì)控品；所述陽(yáng)性質(zhì)控品由兩份人肺炎衣原體感染者的抗人肺炎衣原體IgM抗體
陽(yáng)性的血清及兩份抗人肺炎衣原體IgG抗體為陽(yáng)性的血清組成；所述陰性質(zhì)控品
是四份抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血清；其特征在于：所述方法
包括以下步驟：
1)抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠的制備：
1.1)重組M98-His融合蛋白的制備、純化：
1.1.1)對(duì)人肺炎衣原體98KD外膜蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲取人肺炎衣
原體98KD膜蛋白胞外結(jié)構(gòu)域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對(duì)應(yīng)的基因序
列；
1.1.2)在步驟1.1.1)中所得到的基因序列的5’端及3’端分別引入酶切位
點(diǎn)并化學(xué)合成全基因序列，同時(shí)標(biāo)記記為M98；
1.1.3)將步驟1.1.2)中所得到的M98按分子生物學(xué)方法克隆入表達(dá)載體
pET-28a(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)重組M98-His融合蛋白；所述重組M98-His
融合蛋白以包涵體表達(dá)形式存在于基因工程菌體中；
1.1.4)用鎳柱純化步驟1.1.3)所得到的重組M98-His融合蛋白，SDS-PAGE
檢測(cè)其純度后，再對(duì)重組M98-His融合蛋白進(jìn)行復(fù)性，經(jīng)bradford試劑盒進(jìn)行蛋
白質(zhì)濃度測(cè)定后，用PBS緩沖液調(diào)整濃度為0.2mg/mL；所述PBS緩沖液中各成分
含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，所
述PBS緩沖液的pH＝7.4；
1.2)納米磁珠的包被：
1.2.1)取5mg磁珠，用1mlMES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進(jìn)
行磁分離后移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe₃O₄為內(nèi)核、粒徑為1150nm的羧
基磁珠；所述MES緩沖液是質(zhì)量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代)乙磺酸；所述MES
緩沖液的pH＝6.0；所述納米磁分離器的磁性強(qiáng)度是0.4T；
1.2.2)依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是8-12mg/ml的
EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-10mg/ml的sulfo-NHS
溶液各0.5ml，以10-40rpm于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化1hr，置于納米磁分離器中進(jìn)
行磁分離后移除上清，用1ml步驟1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的
磁珠；
1.2.3)取5個(gè)離心管，在每個(gè)離心管中加入200μL步驟1.2.2)所得到的活
化后的磁珠，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用
PBS緩沖液稀釋的濃度為50-200μg/ml的由步驟1.1.4)所制備的重組M98-His
融合蛋白溶液各1ml，室溫下以15rpm于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2-6h，置于納米磁
分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清后，各加入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖
液，室溫下以15rpm于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2h以封閉磁珠上未與抗體反應(yīng)的羧基；
所述PBS緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，
1.44g/LNa₂HPO₄，所述PBS緩沖液的pH＝7.4；
1.2.4)封閉反應(yīng)完成后，將該5個(gè)離心管置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后
移除上清，各用1ml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下：
8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.5ml/LTween-20，
所述洗滌緩沖液的pH＝7.4；
1.2.5)向各個(gè)離心管中分別加入1ml保存緩沖液重懸磁珠，置于4℃保存
備用；至此制得抗人肺炎衣原體抗體捕獲納米磁珠；所述保存緩沖液中各成分含
量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.3g/L
NaN₃，5g/LBSA，所述保存緩沖液的pH＝7.4；
2)多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針的制備：
其具體制備方法包括：
2.1)向微量離心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子點(diǎn)、300nmolN-羥
基琥珀酰亞胺sulfo-NHS以及300nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為5
ml，混合溶液，37℃反應(yīng)30min后，透析去除過(guò)量的作為活化劑的sulfo-NHS及
EDC，得到活化后的量子點(diǎn)；所述羧基水溶性量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)是520nm；所述
磷酸鹽緩沖液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，
4g/L氯化鈉；所述磷酸鹽緩沖液的pH＝7.4；
2.2)在步驟2.1)所得到的活化的量子點(diǎn)中，加入2-12nmol的鼠抗人IgM
單克隆抗體，避光反應(yīng)2h，加入單端氨基化聚乙二醇PEG2000-NH₂至終濃度為1％，
封閉未反應(yīng)的活化羧基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng)1h；
2.3)用0.2μmPES濾器過(guò)濾除去步驟2.2)中的抗體聚集物，然后將濾液
轉(zhuǎn)移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4℃下離心15min，除去未發(fā)
生偶聯(lián)反應(yīng)的抗體和反應(yīng)中的副產(chǎn)物；
2.4)收集步驟2.3)中超濾離心管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于2
ml磷酸鹽洗滌液中，再將此溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的50000MW超濾離心管中，以8000
g離心力在4℃下離心15min，收集超濾離心管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，
溶于1ml磷酸鹽保存液中，置于4℃保存?zhèn)溆?，至此制得量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgM
納米探針；所述磷酸鹽洗滌液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L
磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，0.3g/L疊氮鈉，所述磷酸鹽洗
滌液的pH＝7.4；所述磷酸鹽保存液中各成分含量如下：2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295
g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L牛血清白蛋白，0.3g/L疊氮鈉；所述
磷酸鹽保存液的pH＝7.4；
2.5)按與步驟2.1)-2.4)相同的方法利用鼠抗人IgG單克隆抗體與發(fā)射波
長(zhǎng)為600nm的羧基水溶性量子點(diǎn)制得量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgG納米探針；將上述兩
種量子點(diǎn)標(biāo)記的納米探針溶液按體積比1:1混合，即制得多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的
抗人IgM、IgG納米探針；
3)PBST緩沖液的配制：
其具體配制方法包括：
取8gNaCL，0.2gKCl，0.24KH₂PO₄，1.44gNa₂HPO₄，5gBSA，0.3gNaN₃，
0.5mlTween-20溶解于900ml蒸餾水中，用5MNaOH調(diào)整pH至7.4，再定容至1000
ml；
4)質(zhì)控品的制備：
4.1)陽(yáng)性質(zhì)控品：
4.1.1)抗人肺炎衣原體IgM抗體陽(yáng)性質(zhì)控品：由0.5ml人肺炎衣原體感染者
的已確定抗人肺炎衣原體IgM抗體為陽(yáng)性的血清構(gòu)成；
4.1.2)抗人肺炎衣原體IgG抗體陽(yáng)性質(zhì)控品：由0.5ml人肺炎衣原體感染者
的已確定抗人肺炎衣原體IgG抗體為陽(yáng)性的血清構(gòu)成；
4.2)陰性質(zhì)控品：由0.5ml抗人肺炎衣原體IgM、IgG抗體均為陰性的人血
清構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟1.2.2)中，依次加
入用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是10mg/ml的EDC溶液以及用步驟
1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml，以15rpm
于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化1hr，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，用1ml
步驟1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
所述步驟1.2.3)中，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度為150μ
g/ml的由步驟1.1.4)所制備的重組M98-His融合蛋白溶液各1ml，室溫下以15rpm
于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)3h，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清后，各加
入1ml含1mg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液；
所述步驟2.2)中，在步驟2.1)所得到的活化的量子點(diǎn)中，加入6nmol的鼠
抗人IgM單克隆抗體，避光反應(yīng)2h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述量子點(diǎn)是羧基化兩親
聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述磁珠是以超順磁性Fe₃O₄
為內(nèi)核、殼材料為聚苯乙烯、表面官能團(tuán)為羧基、粒徑為1150nm的羧基磁珠。