本發(fā)明公開了一種支原體培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液，基礎(chǔ)培養(yǎng)液主要由豬肺消化湯、1%水解乳蛋白胨Earle液和25%新鮮酵母浸出液組成。試驗(yàn)證明，用豬肺消化湯取代牛心湯制作支原體培養(yǎng)基進(jìn)行支原體培養(yǎng)增殖快、濃度高、效果切確，還可使支原體培養(yǎng)時(shí)動(dòng)物血清的用量降低50%左右，這使人工大規(guī)模培養(yǎng)支原體成為可能。本發(fā)明原料豬肺臟市場(chǎng)量大、材料易得、價(jià)格低廉，因此，應(yīng)用本發(fā)明可大幅降低動(dòng)物支原體培養(yǎng)成本。

1.一種支原體培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液，其特征在于：所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液主要由豬肺消化
湯、1％水解乳蛋白胨Earle液和25％新鮮酵母浸出液組成，按以下步驟制備：
<1>胰腺提取液的制備
取經(jīng)檢疫合格豬的新鮮胰臟，去除脂肪組織，切碎；500g胰臟加入1500mlddH₂O
和500ml無水乙醇，室溫振蕩，100rpm；72h后用濾紙過濾即得；
<2>豬肺消化湯的制備
取經(jīng)檢疫合格豬的新鮮豬肺，去除氣管和淋巴結(jié)締組織，切碎，1500g豬肺加入2000
mlddH₂O，攪拌加熱至80℃，再加入質(zhì)量濃度0.8％的無水NaHCO₃2500ml，混勻后冷至
45℃，加入胰腺提取液500ml、氯仿50ml，混勻置37℃6～7h，之后加濃硫酸40ml，
100℃蒸汽加熱1h，紗布過濾，用1mol/LNaOH溶液調(diào)pH至8，100℃蒸汽加熱1h，趁
熱濾紙過濾，調(diào)節(jié)pH值至7.6，121℃高壓滅菌20min，冷卻即得；
<3>1％水解乳蛋白胨Earle液的制備
配制原液甲：NaCl68.0g，KCl4.0g，NaH₂PO₄·2H₂O1.4g，葡萄糖20.0g，將以
上各成分溶解于500ml水中，即得；
配制原液乙：NaCl2.0g，MgCl₂·6H₂O1.7g，0.4％酚紅液50ml，將以上各成分溶
解于500ml水中，即得；
配制Earle液：原液甲1份，原液乙1份，水18份，混合均勻即得；
將水解乳蛋白胨和Earle液按質(zhì)量體積比1:100混合完全溶解，裝瓶，115℃高壓滅
菌20min，冷卻即得；
<4>25％新鮮酵母浸出液的制備
將250g干面包酵母或啤酒酵母置于1L的ddH₂O中，浸泡1h后加熱至沸騰、冷卻，
3000r/min離心20min，取上清液，用1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8，濾紙初濾后，0.22
μl濾膜過濾除菌，即得；
將步驟<2>至<4>獲得的豬肺消化湯、1％水解乳蛋白胨Earle液和25％新鮮酵母浸出液
按體積百分?jǐn)?shù)48％、50％、2％在無菌條件下混合，即得基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的支原體培養(yǎng)基，其特征在于還包括動(dòng)物血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的支原體培養(yǎng)基，其特征在于：每90～95ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入5～
10ml無菌的動(dòng)物血清。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的支原體培養(yǎng)基，其特征在于：所述動(dòng)物血清為馬血清或小牛血
清。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述支原體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
<1>胰腺提取液的制備
取經(jīng)檢疫合格豬的新鮮胰臟，去除脂肪組織，切碎；500g胰臟加入1500mlddH₂O
和500ml無水乙醇，室溫振蕩，100rpm；72h后用濾紙過濾即得；
<2>豬肺消化湯的制備
取經(jīng)檢疫合格豬的新鮮豬肺，去除氣管和淋巴結(jié)締組織，切碎，1500g豬肺加入2000
mlddH₂O，攪拌加熱至80℃，再加入質(zhì)量濃度0.8％的無水NaHCO₃2500ml，混勻后冷至
45℃，加入胰腺提取液500ml、氯仿50ml，混勻置37℃6～7h，之后加濃硫酸40ml，
100℃蒸汽加熱1h，紗布過濾，用1mol/LNaOH溶液調(diào)pH至8，100℃蒸汽加熱1h，趁
熱濾紙過濾，調(diào)節(jié)pH值至7.6，121℃高壓滅菌20min，冷卻即得；
<3>1％水解乳蛋白胨Earle液的制備
配制原液甲：NaCl68.0g，KCl4.0g，NaH₂PO₄·2H₂O1.4g，葡萄糖20.0g，將以
上各成分溶解于500ml水中，即得；
配制原液乙：NaCl2.0g，MgCl₂·6H₂O1.7g，0.4％酚紅液50ml，將以上各成分溶
解于500ml水中，即得；
配制Earle液：原液甲1份，原液乙1份，水18份，混合均勻即得；
將水解乳蛋白胨和Earle液按質(zhì)量體積比1:100混合完全溶解，裝瓶，115℃高壓滅
菌20min，冷卻即得；
<4>25％新鮮酵母浸出液的制備
將250g干面包酵母或啤酒酵母置于1L的ddH₂O中，浸泡1h后加熱至沸騰、冷卻，
3000r/min離心20min，取上清液，用1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8，濾紙初濾后，0.22
μl濾膜過濾除菌，即得；
將步驟<2>至<4>獲得的豬肺消化湯、1％水解乳蛋白胨Earle液和25％新鮮酵母浸出液
按體積百分?jǐn)?shù)48％、50％、2％在無菌條件下混合，即得基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的支原體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于還包括以下步驟：
<5>培養(yǎng)基的完善
在無菌狀態(tài)下，每90～95ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入5～10ml無菌的動(dòng)物血清，混勻，
將培養(yǎng)基分裝到試管中，每支試管10ml，-20℃保存。