一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發酵制備正丁醇的方法，它涉及一種制備正丁醇的方法。本發明要解決現有生物發酵生產正丁醇過程中底物成本高，木質纖維素水解過程中商品酶的應用造成成本上升，以及單一菌種纖維素酶系比例失衡造成的酶活降低等問題。方法：將預處理木質纖維素應用源于綠色木霉和黑曲霉纖維素酶混合粗酶液進行生物酶法水解，得到的糖液加入氮源、無機鹽和維生素后通入氮氣除氧，接種丙酮丁醇梭菌種子液進行厭氧發酵生產正丁醇。本發明提高了纖維素酶解過程中生物酶的活性，降低了生物發酵生產正丁醇過程中底物和酶法水解的成本消耗，減少了設備損耗和環境污染問題；本發明中混合粗酶液糖化水解效率達到75％。

1.一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發酵制備正丁醇的方法，其特征在于，
它是按以下步驟實現：
一、對木質纖維素采用堿預處理：木質纖維素與質量百分含量為2％的氫氧化鈉溶液按
質量比為1:9的比例混合，得混合溶液，將混合溶液在100℃條件下處理2h，然后將混合
溶液經蒸餾水洗滌至pH為中性并在105℃條件下烘干至恒重，得到的殘余固體即為預處理
的木質纖維素；
二、混合粗酶液的獲得：將綠色木霉和黑曲霉分別在好氧條件下采用液體發酵的方法
獲得綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液；然后將綠色木霉纖維素酶粗酶液
和黑曲霉纖維素酶粗酶液按體積比為3:1的比例混合，得到混合纖維素酶粗酶液；
其中，液體發酵的具體操作如下：分別綠色木霉孢子和黑曲霉孢子接種到綠色木霉的
液體產酶培養基和黑曲霉的液體產酶培養基中，然后在好氧發酵溫度為28～32℃、轉速為
80～120r/min的條件下振蕩培養4～6d，發酵過程結束后發酵液分別以5000g離心15min，
分別收集上清液，所得上清液分別為綠色木霉纖維素酶粗酶液和黑曲霉纖維素酶粗酶液；
三、將步驟一得到的預處理的木質纖維素按質量體積比為0.8～1.5g:10mL的比例加入到
步驟二得到的混合纖維素酶粗酶液中，在水解體系pH值4.0～5.5、溫度為50～60℃的條件
下對預處理的木質纖維素進行酶水解48～60h，然后經5000g離心15min，取上清液后濃
縮，再加入厭氧培養基中并通入氮氣除氧，再接入丙酮丁醇梭菌種子液進行厭氧發酵96h，
即完成利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發酵制備正丁醇；
其中，步驟二中所述的綠色木霉的孢子接種量為10⁸～10⁹個/L，所述的綠色木霉的液體
產酶培養基含有濃度為2.0g/L的KH₂PO₄溶液、濃度為1.4g/L的(NH₄)₂SO₄溶液、濃度為
0.3g/L的MgSO₄·7H₂O溶液、濃度為0.3g/L的CaCl₂溶液、濃度為0.3g/L的尿素溶液、
濃度為20g/L的麩皮溶液、濃度為8g/L的玉米秸稈溶液、濃度為5g/L的豆餅粉溶液以及
微量金屬元素貯液1mL/L；所述的微量金屬元素貯液母液含有濃度為5.0g/L的FeSO₄·7H₂O
溶液、濃度為1.6g/L的MgSO₄溶液、濃度為1.4g/L的ZnSO₄·7H₂O溶液以及濃度為2.0g/L
的CoCl₂溶液；
步驟二中所述的黑曲霉的孢子接種量為10¹²～10¹⁶個/L；所述的黑曲霉的液體產酶培養
基含有濃度為1.0g/L的麩皮溶液、濃度為1.4g/L的(NH₄)₂SO₄溶液、濃度為2.0g/L的KH₂PO₄
溶液、濃度為0.3g/L的CaCl₂溶液、濃度為0.3g/L的MgSO₄溶液、濃度為1.6mg/L的
FeSO₄·7H₂O溶液、濃度為1.4mg/L的ZnSO₄·7H₂O溶液和濃度為2.0mg/L的CoCl₂溶液；
步驟三中所述的厭氧培養基中含有濃度為2.0g/L的酵母粉溶液、濃度為2.5g/L的
KH₂PO₄溶液、濃度為3.0g/L的Na₂HPO₄溶液、濃度為1.0g/L的NH₄Cl溶液、濃度為0.4
g/L的MgSO₄溶液、濃度為0.5g/L的半胱氨酸溶液、維生素儲液lmL/L、微量金屬元素儲
液1mL/L以及濃度為0.05g/L的刃天青溶液；所述維生素貯液每1L是由50.0mg的硫辛酸、
20.0mg的生物素、0.35g的煙酸、5.0mg的鹽酸硫胺素、50.0mg的對氨基苯甲酸、20.0mg
的葉酸、50.0mg的泛酸鈣、1.0mg的維生素B₁₂和100.0mg的鹽酸吡哆醇組成；所述微
量金屬元素儲液每1L由1.5g的FeCl₂、70mg的ZnCl₂、6mg的硼酸0.1g的MnCl₂·4H₂O、
2mg的CuCl₂·2H₂O、0.19g的CoCl₂·6H₂O、24mg的NiCl₂·6H₂O、36mg的Na₂MO₄·H₂O、
15mg的Na₂WO₄·2H₂O和15mg的Na₂SeO₄·5H₂O組成；
步驟三中所述的丙酮丁醇梭菌，其種子液接種量是按體積百分含量為2％的生長至對數
期、600nm條件下OD值為1.0的液體懸濁液。
2.根據權利要求1所述的一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發酵制備正丁
醇的方法，其特征在于步驟三中所述的取上清液后濃縮是指采用減壓蒸餾的方法濃縮至上
清液2～4倍濃度。
3.根據權利要求1所述的一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發酵制備正丁
醇的方法，其特征在于步驟二中所述的在好氧發酵溫度為28～32℃、轉速為100～120r/min
的條件下振蕩培養4d。
4.根據權利要求1所述的一種利用混合纖維素酶粗酶液水解木質纖維素發酵制備正丁
醇的方法，其特征在于步驟三中所述的在水解體系pH值4.0～5.5、溫度為55～60℃的條件
下對預處理的木質纖維素進行酶水解48h。