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植酸酶玉米BVLA430101轉化體PCR檢測的特異性引物和探針及其應用

  • 專利類型:發明專利
  • 有效期:不限
  • 發布日期:2022-01-08
  • 技術成熟度:通過小試
交易價格: ¥面議
  • 法律狀態核實
  • 簽署交易協議
  • 代辦官方過戶
  • 交易成功

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  • 技術(專利)類型 發明專利
  • 申請號/專利號 CN201310319438.1 
  • 技術(專利)名稱 植酸酶玉米BVLA430101轉化體PCR檢測的特異性引物和探針及其應用 
  • 項目單位 山東省農業科學院植物保護研究所
  • 發明人 路興波,孫紅煒,張廣遠,楊淑珂,高瑞,徐曉輝,李凡 
  • 行業類別 醫藥制造-中成藥
  • 技術成熟度 通過小試
  • 交易價格 ¥面議
  • 聯系人 李小霏
  • 發布時間 2022-01-08  
  • 01

    項目簡介

    本發明公開了植酸酶玉米BVLA430101轉化體PCR檢測的特異性引物和探針及其應用,所述的特異性引物分別為:BVLA430101-1F:5ˊ-CACTGCCCGCTTTCCA-3ˊ,BVLA430101-2R:5ˊ-TGGGCACATACCTAGTGACTGTA-3ˊ,探針序列為:BVLA430101-P:FAM-5ˊ-CCTGTCGTGCCAGTCACTCAAATGTCTAC-3ˊ-TAMRA。利用本發明設計的引物與探針,建立了植酸酶玉米轉化體特異性定性PCR檢測方法、SYBR?Green?I實時熒光定量PCR檢測方法和TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法。
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  • 02

    說明書

    1.一種植酸酶玉米BVLA430101轉化體實時熒光PCR檢測的特異性引物及探針,其特征是:所述的特異性引物,正向、反向引物序列分別為:BVLA430101-1F:5'-CACTGCCCGCTTTCCA-3'BVLA430101-2R:5'-TGGGCACATACCTAGTGACTGTA-3',所述的PCR檢測的探針,序列為:BVLA430101-P:FAM-5'-CCTGTCGTGCCAGTCACTCAAATGTCTAC-3'-TAMRA;植酸酶玉米BVLA430101轉化體特異性引物擴增序列如下:CACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGTCACTCAAATGTCTACCCTTCTTATTAGTTACTACATCATATAGTCATACACTCATACATGCAGAGTTATACAGTCACTAGGTATGTGCA。2.如權利要求1所述的特異性引物在定性檢測植酸酶玉米BVLA430101的應用。3.如權利要求2所述的應用,其特征是,應用方法的具體步驟是:(1)提取待檢測樣品基因組DNA,并以此為模板,利用BVLA430101-1F和BVLA430101-2R引物組合進行PCR擴增;(2)上述PCR擴增產物以瓊脂糖凝膠電泳分離,EB染色后鑒定是否存在擴增產物;若存在擴增產物,則待檢測樣品為含有植酸酶玉米或其相關產品;若不存在擴增產物,則待檢測樣品中不含植酸酶玉米成分;步驟(1)所述的PCR擴增為:95℃5min預變性;94℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,35個循環;72℃延伸7min。4.如權利要求1所述的特異性引物在SYBRGreenI實時熒光定量檢測植酸酶玉米BVLA430101的應用。5.如權利要求4所述的應用,其特征是,應用方法的具體步驟是:(1)建立植酸酶玉米BVLA430101轉化體特異性基因和zSSIIb基因的SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線;①提取植酸酶玉米標準品基因組DNA進行梯度稀釋,然后向各稀釋液中加入植酸酶玉米BVLA430101轉化體特異性引物,以及zSSIIb基因的國家標準引物,進行擴增;②擴增后,測定各稀釋液中相關熒光標記物的Ct值,該Ct值與拷貝數的自然對數呈線性關系,據此繪制植酸酶玉米SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的SYBRGreenI實時熒光定量PCR標準曲線;(2)提取待檢測樣品基因組DNA,得基因組DNA提取液,然后向基因組DNA提取液中加入植酸酶玉米BVLA430101轉化體特異性引物,以及zSSIIb基因的國家標準引物,進行擴增;擴增后,測定基因組DNA提取液中相關熒光標記物的Ct值,然后根據上述繪制的植酸酶玉米定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的定量PCR標準曲線,計算出相應的拷貝數,則植酸酶玉米BVLA430101轉化體特異性基因拷貝數與玉米內標準基因zSSIIb基因的拷貝數之比,即為待檢測樣品中植酸酶玉米BVLA430101的百分含量;步驟(1)和(2)中,zSSIIb的國家標準引物序列如下:zSSIIb-1F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'zSSIIb-2R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3';植酸酶玉米BVLA430101轉化體特異性引物序列如下:BVLA430101-1F:5'-CACTGCCCGCTTTCCA-3'BVLA430101-2R:5'-TGGGCACATACCTAGTGACTGTA-3'所述步驟(1)和(2)中,擴增的參數均如下:擴增反應體積為20μL,2×FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Rox)10μL,濃度為10μmolL-1的正向引物0.4μL,濃度為10μmolL-1的反向引物0.4μL,ddH2O8.2μL,DNA模板1μL;擴增反應條件:95℃10min預變性;95℃變性15s,60℃退火延伸30s,在60℃收集熒光信號,共計40個循環。6.如權利要求1所述的特異性引物和探針在TaqMan探針實時熒光定量檢測植酸酶玉米BVLA430101的應用。7.如權利要求6所述的應用,其特征是,應用方法的具體步驟是:(1)建立植酸酶玉米BVLA430101轉化體特異性基因和zSSIIb基因的TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線;①提取轉植酸酶基因玉米標準品基因組DNA進行梯度稀釋,然后向各稀釋液中加入植酸酶玉米BVLA430101轉化體特異性引物和熒光標記探針,以及zSSIIb基因的國家標準引物和熒光標記探針,進行擴增;②擴增后,測定各稀釋液中相關熒光標記物的Ct值,該Ct值與拷貝數的自然對數呈線性關系,據此繪制植酸酶玉米TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的TaqMan探針實時熒光定量PCR標準曲線;(2)提取待檢測樣品基因組DNA,得基因組DNA提取液,然后向基因組DNA提取液中加入植酸酶玉米BVLA430101轉化體特異性引物和熒光標記探針,以及zSSIIb基因的國家標準引物和熒光標記探針,進行擴增;擴增后,測定基因組DNA提取液中相關熒光標記物的Ct值,然后根據上述繪制的植酸酶玉米定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的定量PCR標準曲線,計算出相應的拷貝數,則植酸酶玉米BVLA430101轉化體特異性基因拷貝數與玉米內標準基因zSSIIb的拷貝數之比,即為待檢測樣品中轉植酸酶玉米BVLA430101的百分含量;所述步驟(1)①和(2)中,zSSIIb基因的國家標準引物和熒光標記探針如下:zSSIIb-1F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'zSSIIb-2R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'zSSIIb-P:FAM-5'-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3'-TAMRA;植酸酶玉米轉化體特異性引物和熒光標記探針序列如下:BVLA430101-1F:5'-CACTGCCCGCTTTCCA-3'BVLA430101-2R:5'-TGGGCACATACCTAGTGACTGTA-3'BVLA430101-P:FAM-5'-CCTGTCGTGCCAGTCACTCAAATGTCTAC-3'-TAMRA。所述步驟(1)①和(2)中,擴增的參數均如下:擴增反應體積為20μL,2×PremixExTaq(Rox)12.5μL,濃度為10μmolL-1的Forwardprimer1μL,濃度為10μmolL-1的Reverseprimer1μL,濃度為10μmolL-1的TaqManprobe0.5μL,ddH2O4μL,DNA模板1μL;擴增反應條件:95℃10min預變性;95℃變性15s,60℃退火延伸30s,在60℃收集熒光信號,共計40個循環。8.權利要求5或7所述的應用,其特征是,所述的DNA梯度稀釋是按照5倍倍比進行稀釋。
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專利技術附圖

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