本發(fā)明涉及一種基于雄激素受體體外受體-配體結(jié)合效應(yīng)的環(huán)境類雄激素的ELISA定量檢測方法。方法包括將雄激素受體與環(huán)境類雄激素結(jié)合后，雄激素受體二聚化變構(gòu)，結(jié)合含有雄激素反應(yīng)元件核心序列5′-GGAACAnnnTGTATC-3′的生物素標記的DNA探針，形成生物素DNA探針-雄激素受體-環(huán)境類雄激素復(fù)合物，并采用雄激素受體單克隆抗體對其吸附分離，再用鏈親和素標記的辣根過氧化物酶進行ELISA檢測，從而評估樣本中類雄激素的效應(yīng)和含量。本發(fā)明方法操作簡便、快捷，靈敏度高，檢測限可達pM級?？蓮V泛用于食品、環(huán)境檢測等領(lǐng)域。

1.一種基于雄激素受體體外受體-配體結(jié)合效應(yīng)的環(huán)境類雄激素的ELISA定量
檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：
(1)設(shè)計合成5′端用生物素標記的DNA探針正鏈，其全序列中含有2個雄激素
反應(yīng)元件核心序列5′-GGAACAnnnTGTATC-3′，其中n為任意核苷酸；
(2)合成步驟(1)所述探針的堿基互補連，等量加入(1)所述探針，在退火緩沖液
中退火，形成5’端用生物素標記的DNA雙鏈探針；5′端用生物素標記的DNA探針
正鏈的核苷酸序列為SEQ?No1；
(3)將雄激素受體特異的鼠源性單克隆抗體McAb加入到羊抗鼠IgG包被的磁珠
里，洗滌，得到McAb-磁珠固相載體；
(4)將含環(huán)境類雄激素的待檢樣品與雄激素受體在結(jié)合緩沖液中4℃振搖孵育1
小時，然后37℃孵育30分鐘，使環(huán)境類雄激素與雄激素受體結(jié)合，受體發(fā)生變構(gòu)，
暴露受體DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，形成雄激素受體-環(huán)境類雄激素復(fù)合物；
(5)向步驟（4）復(fù)合物中加入步驟（2）所述5′端用生物素標記的DNA雙鏈探
針，37℃反應(yīng)10分鐘，形成生物素DNA探針-雄激素受體-環(huán)境類雄激素復(fù)合物；
(6)將步驟（5）所得生物素DNA探針-雄激素受體-環(huán)境類雄激素復(fù)合物溶液中
加入到步驟（3）所述的McAb-磁珠固相載體，形成雄激素受體-McAb-磁珠IgG復(fù)合
物，用磁力架吸附收集此復(fù)合物，洗去未結(jié)合的探針；
(7)向步驟（6）所述的復(fù)合物中加入鏈親和素標記的辣根過氧化物酶，37℃孵
育0.5-1小時，使DNA探針上標記的生物素與鏈親和素特異性結(jié)合，磁力架收集磁
珠復(fù)合物，洗去未結(jié)合的酶；
(8)向步驟（7）磁珠復(fù)合物中加入辣根過氧化物酶的催化底物四甲基聯(lián)苯胺和
受氫體過氧化氫，37℃孵育10-30分鐘，催化底物顯色；
(9)向步驟（8）已顯色的混合液中加入含有硫酸的終止液終止顯色反應(yīng)，磁力
架吸附磁珠，收集上清；
(10)將步驟（9）收集的上清加入到聚苯乙烯酶標板，也即ELISA板，在ELISA
檢測儀上，于450nm處，測定各孔吸光度值，與以睪酮或雙氫睪酮為標準品所作的
標準曲線比對，確定待測樣品中類雄激素物質(zhì)的累計當量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于雄激素受體體外受體-配體結(jié)合效應(yīng)的環(huán)境
類雄激素的ELISA定量檢測方法，其特征在于：步驟（4）中的結(jié)合緩沖液成分及配
比為50mM?Tris-HCl,1mM?EDTA，500mM?KCl，2mM二硫赤蘚糖醇，2mg/ml牛
血清白蛋白（BSA），5%甘油，結(jié)合緩沖液pH=7.6。